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Im aktuellen Laborjournal-Special zur Synthetischen Biologie widmen wir einen Beitrag dem Design genetischer Schaltkreise. Es geht um programmierbare Genkonstrukte, die in der Zelle Signale registrieren, verrechnen und als Output ein bestimmtes Verhalten generieren. Zum Beispiel Zeitschaltuhren, die Hefekolonien vorübergehend als verzweigte Filamente wachsen lassen, bis sich die Zellen nach Ablauf des Countdowns wieder voneinander lösen. Oder einen genetischen Detektor, der die Zelle in die Apoptose schickt, falls sie typische Krebsmarker exprimiert.
Sucht man nach Arbeiten zum Thema, stößt man auf weit mehr, als in einem Laborjournal-Artikel Platz findet. Wie diese Kuriosität aus dem Jahre 2003: Noch bevor komplexere genetische Schaltkreise in lebenden Zellen etabliert waren, hatten Milan Stojanovic von der Colombia University und Darko Stefanovic von der University New Mexico einzelsträngige DNA-Moleküle in vitro programmiert. Hierfür modifizierten sie ein DNAzym, das eine spezifische DNA-Sequenz als Substrat erkennt und schneidet. Heraus kam ein Tic-Tac-Toe-Spielautomat im Multiwell, der niemals verliert. Sie tauften ihren molekularen Computer auf den Namen MAYA, für Molecular Array of YES and AND-AND-NOT gates (Nat Biotechnol. 21: 1069-74).
Das Spielfeld realisierten die beiden Molekültüftler in neun verschiedenen Reaktionsgefäßen, die zu einem drei-mal-drei-Quadrat angeordnet sind (wie man es vom Tic-Tac-Toe aus Schulzeiten kennt). MAYA teilt ihren Spielzug durch Fluoreszenz im jeweiligen Schälchen mit. Denn das Substrat-Oligonukleotid trägt an der einen Seite ein Fluorophor, auf der anderen Seite aber einen Quencher, der die Fluoreszenz unterdrückt. Erst wenn das DNAzym das Substrat in zwei Stücke zerschneidet, werden Quencher und Fluorophor getrennt, so dass die Lösung im Reaktionsgefäß leuchtet. Jetzt kommt es darauf an, dass die DNAzyme im jeweiligen Well „wissen“, wann sie ihr Substrat schneiden müssen und wann nicht.
Wie aber programmiert man ein DNAzym? Der unbearbeitete ‚Rohling’ der von Stojanovic und Stefanovic verwendeten DNA-Schere hat ein aktives Zentrum in der Mitte, das sich zu einer haarnadelartigen Sekundärstruktur formt. Sein Substrat erkennt das DNAzym über die beiden Enden seines Strangs. Die strecken sich wie zwei Ärmchen beiderseits des aktiven Zentrums nach außen und können dann an die komplementäre Sequenz des Substrates binden; erst dann kann das aktive Zentrum schneiden. Um katalytisch arbeiten zu können, muss das DNAzym also beide Ärmchen frei haben und ein funktionierendes aktives Zentrum besitzen. Beides kann man modifizieren und von außen durch Input-Signale ein- oder ausschalten.
Verlängert man eines der beiden Ärmchen um Basenfolgen, von denen einige komplementär zur Substraterkennungssequenz sind, so formt sich dieser Abschnitt zu einer Schleife und bildet eine Haarnadelstruktur; die Substrat-Erkennungsdomäne funktioniert nun nicht mehr, weil sie verdeckt ist. Da das DNAzym aber beide Ärmchen braucht, um das Substrat zu binden, ist es durch diese Haarnadel-Modifikation deaktiviert. Man kann das Enzym aber aktivieren, indem man ein Oligonukleotid zugibt, das komplementär zu einem Stück in der Haarnadel ist. Es bindet dann, öffnet so die Schleife und gibt die Erkennungssequenz wieder frei.
Das zupipettierte kurze DNA-Stück fungiert also als aktivierendes Input-Signal, das letztlich Fluoreszenz in der Reaktionslösung einschaltet. Es lassen sich auch komplexere Bedingungen für das Aktivieren des DNAzyms implementieren: Nur wenn Input a und Input b vorhanden sind, soll die Lösung leuchten. Wie das geht? Ganz einfach, das DNAzym hat ja noch ein zweites Ärmchen, das man zur Haarnadel umbauen kann. Dann braucht es für beide Ärmchen je eine komplementäre Input-Sequenz als Aktivierungssignal.
Stojanovic und Stefanovic haben bei vielen ihrer DNAzyme außerdem das aktive Zentrum modifiziert und dessen Haarnadel verlängert – ebenfalls mit komplementären Sequenzen für jeweils ein charakteristisches Input-Oligonukleotid. Das aktive Zentrum schneidet das Substrat aber nur, wenn die Haarnadel geschlossen ist. Die Input-DNA jedoch öffnet die Struktur und wirkt in diesem Fall als DNAzym-Stopper.
Das Schöne an diesem Konzept: Weil sowohl die Substraterkennung als auch die aktivierende oder hemmende Wirkung der Input-Oligonukleotide über Basenpaarung funktioniert, hat man einen leicht handhabbaren Baukasten. Derselbe Input kann beim einen DNAzym die Schleife am Substratärmchen freigeben und an einem anderen DNAzym das aktive Zentrum ausschalten. Der „Programmierer“ kann charakteristische Input-Basenfolgen einfach selbst festlegen und unzählige DNAzyme basteln, die auf speziell zugeschnittene Input-Oligonukleotide reagieren. Über diese Kombinationsmöglichkeiten lässt sich ein Spielautomat konstruieren. Der menschliche Spieler kommuniziert mit dem Multiwell-Computer, indem er bei jedem Spielzug Input-DNA zugibt.
Weil die Biochemie der Kombinatorik dann doch Grenzen auferlegt, haben die Autoren für MAYA eine vereinfachte Tic-Tac-Toe-Variante entworfen: Es beginnt immer der Automat und wählt dabei das mittlere Feld. Der menschliche Spieler darf sich bei seinem ersten Spielzug nur zwischen dem Feld links oben und links in der Mitte entscheiden. Letztere Einschränkung hat aber keine Auswirkungen auf die Vielfalt der möglichen Spielzüge. Angenommen, der Mensch hätte sein Kreuz lieber auf einem der anderen acht verbleibenden Felder hinterlassen: Durch Drehen oder Spiegeln des gesamten Spielfeldes könnte man immer eine gleichwertige Situation herstellen, in der dieses erste Kreuz des Menschen links oben oder links in der Mitte liegt.
Damit der menschliche Spieler weiß, wo er sein Kreuz macht, sind die Reaktionsgefäße durchnummeriert, beginnend mit der 1 oben links, dann geht es zeilenweise weiter bis zur 9 unten rechts. Weil der Automat immer beginnt und in Feld 5 startet, kommen für den menschlichen Spieler nur acht verschiedene Felder in Frage, die er irgendwann im Spielverlauf einmal ankreuzen kann. Dementsprechend hat er acht verschiedene Reagenzien zur Auswahl; in jedem ist ein anderes Input-Oligonukleotid gelöst. Gibt der Mensch also in einem Spielzug ‚Input 4’ zu, dann hat er sein Kreuz in Feld 4 gemacht.
Die Input-DNA muss er immer in jedes Reaktionsgefäß geben. Denn weil die einzelnen Felder nicht miteinander kommunizieren können, muss jedes einzelne Feld „wissen“, welche Spielzüge der Mensch bereits ausgeführt hat. Dann wertet jedes Reaktionsgefäß für sich allein die „Eingabe“ aus und entscheidet, ob es fluoresziert oder nicht.
Schematische Darstellung des DNA-Automaten MAYA: Dargestellt sind die DNAzyme in den einzelnen durchnummerierten Reaktionsgefäßen. Die Zahlen auf den DNAzymen geben an, welche Input-DNA binden kann. Grün markiert sind die Domänen, die ein Input-Signal brauchen, um aktiviert zu werden (die Substrat-erkennenden „Ärmchen“). Falls zwei „grüne“ Domänen vorhanden sind, müssen auch beide aktiviert werden, damit das DNAzym schneiden und Fluoreszenz auslösen kann. Rot markierte Domänen werden durch den passenden Input abgeschaltet (betrifft immer das aktive Zentrum mit der „DNA-Schere“). Selbst wenn beide Ärmchen aktiviert sind, kann das DNAzym nicht schneiden, falls schon Input-DNA an eine rote Domäne gebunden hat und damit das aktive Zentrum blockiert. Es genügt, wenn eine einzige DNAzym-Sorte in der Lösung aktiviert wird, damit die Lösung im Reaktionsgefäß leuchtet.
(Abb: Mario Rembold nach Stojanovic & Stefanovic 2003)
Nach jedem Spielzug des Menschen wird genau eines der Felder zu leuchten beginnen – mit diesem Leuchten hat MAYA dann als Reaktion ihren Spielzug ausgeführt. Für den menschlichen Spieler gibt es in der hier beschriebenen Pilotversion des Spiels noch kein eigenes Fluoreszenzsignal. Man könnte stattdessen einfach mit Edding eine Markierung um das ausgewählte Well zeichnen, um sein Kreuzchen zu machen.
Um das Spiel zu starten, gibt der Mensch in jedes Gefäß Magnesiumionen – ein notwendiger Cofaktor für die DNAzyme. In Feld 5 (genau in der Mitte) befinden sich nur DNAzyme ohne Modifikationen. Hier ist also keine Input-DNA zum Aktivieren notwendig, so dass das Feld sofort leuchtet. Alle anderen Wells bleiben zunächst inaktiv. Jetzt ist der menschliche Spieler am Zug. Angenommen, er pipettiert nun ‚Input 1’ in jedes Reaktionsgefäß – damit macht er sein Kreuz oben links in Feld 1. Klar, dass MAYA in Feld 1 nun keine Fluoreszenz mehr auslösen darf.
Tut sie auch nicht, denn in diesem Reaktionsgefäß schwimmen nur DNAzyme mit einem modifizierten Substrat-Ärmchen; und das bräuchte ‚Input 4’ um aktiviert zu werden. In Feld 4 wiederum aktiviert ‚Input 1’ jetzt ein DNAzym – dort macht der Automat also sein Kreuz.
Nehmen wir an, der menschliche Spieler wäre nun unaufmerksam und entscheidet sich im nächsten Zug für Feld 2, pipettiert also ‚Input 2’ in alle Schälchen. Ein Fehler, den MAYA sofort ausnutzt. In Gefäß 6 gibt es nämlich ein modifiziertes DNAzym, dessen eines Ärmchen bereits im vorangegangenen Spielzug durch ‚Input 1’ befreit worden war. ‚Input 2’ entwirrt nun auch den Loop auf der anderen Seite. Befände sich ‚Input 6’-DNA in der Lösung, wäre das reaktive Zentrum blockiert. Doch ‚Input 6’ kam bislang nicht zum Einsatz, also schneidet das DNAzym sein Substrat, Feld 6 leuchtet. MAYA hat waagerecht in der Mitte drei Kreuze nebeneinander und somit gewonnen. Tatsächlich ist MAYA unbesiegbar; man kann bestenfalls ein Unentschieden herausspielen (in der Abbildung ist der Automat schematisch dargestellt, so dass Sie selbst einige Spielzüge durchgehen können).
Zugegeben, der molekulare Spielautomat, den Stojanovic und Stefanovic vor mehr als einem Jahrzehnt entworfen haben, ist nicht sehr nutzerfreundlich. So muss man immer eine Viertelstunde warten, bis die DNAzyme genügend Substrat umgesetzt haben, um Fluoreszenz zu erzeugen. MAYA braucht also recht lange, um ihren Spielzug mitzuteilen. Außerdem gibt es gelegentlich ein schwaches Leuchten in Wells, die eigentlich dunkel bleiben müssten. Die Forscher haben lange an den Oligonukleotiden herumgetüftelt, bis MAYA korrekt lief. „Es ist einfach noch nicht genügend bekannt über die Sequenzspezifität von DNAzymen, um ihre Funktion in komplexen Mischungen vorauszusagen“, beschreibt Darko Stefanovic die Herausforderungen beim „Einprogrammieren“ der Spielregeln.
Nichtsdestotrotz hatten Stojanovic und Stefanovic zusammen mit anderen Kollegen an ihrem Automaten weitergearbeitet und drei Jahre Später MAYA II vorgestellt, mit noch mehr DNAzymen. Jetzt darf der menschlicher Spieler in seinem ersten Spielzug ein beliebiges Feld auswählen, und MAYA II zeigt die Kreuze seines Gegners auch in einer eigenen Fluoreszenzfarbe an. Sehr viel anschaulicher als in den Originalpublikationen haben die Autoren die Funktion der MAYA-Automaten im November 2008 im Scientific American erklärt.
Klar, der molekulare Tic-Tac-Toe-Automat im Multiwell war zunächst mal ein Proof of Concept, um zu testen, wie man Nukleinsäuren für komplexe Verrechnungen nutzen kann. Trotzdem steckt dahinter mehr als bloße Spielerei, betont Stefanovic. „Erst vor kurzem haben wir an praktischer Diagnostik gearbeitet“. Er und einige Kollegen forschen nämlich an DNA-basierten Sensoren, um Pathogene zu detektieren (Chembiochem 16: 725-30).Spannend wäre die Nutzung programmierbarer Nukleinsäure-Enzyme auch in lebenden Zellen für genetische Schaltkreise. Hier kommen dann aber nur die RNA-Pendants in Frage, deren Bauanleitung man ja ins Erbgut der Wirtszelle einfügen kann. Tatsächlich arbeiten Forscher bereits mit solchen ‚Riboswitches’, denn auch RNAs lassen sich mit Loops und Hairpins modifizieren, die mit komplementären Oligonukleotiden interagieren. Ähnlich den DNAzymen kann man auch auf solchen Ribozymen Logikoperationen implementieren, wie Maung Win und Christina Smolke bereits 2008 gezeigt hatten (Science 322 :456-60 ). Für MAYA hatten sich die Tic-Tac-Toe-Fans damals aber bewusst gegen die zelltauglicheren Ribozyme entschieden, „ganz einfach weil man in vitro besser mit DNA als mit RNA arbeiten kann“, so Stefanovic.
Nun möchten wir niemanden anstiften, wertvolle Arbeitszeit mit Spielereien zu vertrödeln. Aber falls Sie auch schon mal einen „nassen Automaten“ gebastelt, Labormaterial für analoge Computerspiele zweckentfremdet oder gar eine MAYA nachgebaut haben, schicken Sie uns doch mal ein Foto oder einen Videolink (gern auch via Twitter @Lab_Journal).
Mario Rembold