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Reverse Transkriptase ohne Lese-Rechtschreibschwäche

(14.7.16) Texanische Forscher haben eine reverse Transkriptase mit Proofreading-Funktion "erschaffen". Das neue Werkzeug erleichtert den Laboralltag und gibt Einblicke in die Entstehungsgeschichte dieser Enzyme.
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© Jared Ellefson, UTA

Reverse Transkriptasen (RTs) schreiben RNA in DNA um. Sie spielen bei eukaryotischen Zellvorgängen eine kritische Rolle und agieren unter anderem als katalytische Untereinheit von Telomerasen. In Krebszellen sind sie hyperaktiv, weshalb Telomerase-RTs auch als vielversprechende Targets in der Krebstherapie gelten.

Am bekanntesten sind RTs wohl für ihre Rolle bei der Proliferation retroviraler Genome. Auch Evolutionsbiologen interessieren sich für die RTs: Es wird zudem angenommen, dass diese Enzyme in der Frühphase der Evolution den Umstieg von RNA- zu (wesentlich stabilerem) DNA-kodiertem Leben bewerkstelligt haben.

Ein wichtiges Laborwerkzeug mit einer nervigen Schwäche

Im Labor verwendet man rekombinante RT-Enzyme zur Synthese von cDNA, das PCR-taugliche Abbild von RNA. DNA-Polymerasen dagegen lesen und generieren ausschließlich DNA und sind für PCRs unerlässlich.

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Ein Makel von RTs gegenüber DNA-Polymerasen ist ihre Oberflächlichkeit. Sie machen von Natur aus allerhand Schreibfehler, denn es gibt keine Korrektur- oder Löschtaste. Ellefsons Team am Department of Molecular Biosciences an der University of Texas konnte zeigen, dass eine RT-Funktion durchaus mit einer Korrektur-, also einer 3´-5´-Exonukleaseaktivität, kompatibel ist – auch wenn eine solche Enzym-Domänenkombination in der Natur nicht vorkommt (Science 352: 1590-93). Die Autoren haben das Hybrid-Enzym „Reverse Transcription Xenopolymerase“ (RTX) selbst erschaffen, optimiert und seine Funktionalität in Anwendungsbeispielen belegt.

Evolutionäre Synthese: Mehrere Runden Darwin

Das Ganze basiert auf „CSR“ (compartmentalized self-replication), dessen ursprüngliche Erfinderin eine Gruppe aus Cambridge ist (Ghadessy, Ong and Holliger; 2001 PNAS). Das britische Team hatte die Hitzestabilität einer DNA-Polymerase sukzessive auf das elffache erhöht. Das Prinzip ist verblüffend einfach: Die Polymerase repliziert das sie kodierende Gen selbst (Self Replication, SR). Dabei sind die individuellen SR-Reaktionen räumlich getrennt (compartmentalized). Benötigte Zutaten: kloniertes Polymerase-Gen, dNTPs, DNA-Oligos, E.coli. In mehreren Runden aus Plasmidisolierung und -transformation wird im Darwinschen Sinne selektiert: Mutationen, die die Polymeraseeffizienz steigern, reichern sich im Pool der DNA-Amplifikate an und setzen sich langfristig durch.

Zur synthetischen Evolution korrekturlesewilliger RT wählte das texanische Team eine DNA-Polymerase (aus dem Archaeon Thermococcus kodakarensis), die als Monomer vorkommt, extrem hitzestabil und effizient ist. Vor allem aber besitzt die T.-kodakarensis-Polymerase eine Proof-Reading-Domäne. Dieser Polymerase brachten sie die Fähigkeit bei, RNA als Template zu akzeptieren. Polymerasevarianten mit ein bis zwei Mutationen pro Gen wurden in E. coli exprimiert. Durch Emulgieren wurden die Reaktionen in einzelne Kompartimente zerlegt, also voneinander abgetrennt. Die Primer bestanden zunächst hauptsächlich aus DNA und enthielten zehn „untergejubelte“ RNA-Reste. Mit jedem CSR-Zyklus erhöhten Ellefson und Kollegen sukzessive den RNA-Anteil im Primer.

Auf diese Weise erhielten sie nach 18 Zyklen eine Polymerasevariante, die den gesamten eingeschleusten RNA-Abschnitt, nämlich 176 Reste, transkribieren konnte. Sie enthielt ganze 37 Mutationen und akzeptierte RNA- und DNA-Templates gleichermaßen.

Optimierungsarbeit

Mittels deep sequencing der Reaktionsprodukte aus den 18 Zyklen ließ sich deren „Evolutionsgeschichte“ nachverfolgen. Die meisten Mutationen betrafen dabei – wenig überraschend – Bereiche, die der Template-Erkennung dienen. Mit diesem Know-How und anhand von 3D-Modellierungen wählte das Forscherteam die vermeintlich wichtigsten Positionen aus, um klar definierte Polymerasevarienten zu generieren.

Das Endprodukt dieser gezielten Optimierungsarbeit war eine Polymerase, die RNA-Templates akzeptiert und optimal bei ca. 70°C arbeitet. Sie ist somit geeignet für „Single-Enzyme RT-PCRs“, übernimmt sie doch sowohl cDNA-Synthese als auch PCR-Amplifikation. Beachtlich robust scheint diese RTX auch zu sein, denn RNAs unterschiedlichen Ursprungs und herausfordernder Länge (5 kb) sind offenbar kein Problem.

Bei einer RT, die korrekturlesen kann, würde man weniger Schreibfehler vermuten als bei einer klassischen RT. Ein Parallelexperiment mit MMLV (eine kommerzielle rekombinante RT viraler Herkunft) lieferte dafür den Beweis: Verglichen mit MMLV zeigte die RTX eine 3-10-fach niedrigere Fehlerrate.

Anwendungsgebiete von RTX sehen die Texaner darin, Arbeitsabläufe zu vereinfachen, technisch bedingte Artefakte zu minimieren und vor allem verlässlichere Daten aus Transkriptomanalysen zu erzielen. Ein Gewinn für Molekularbiologen ist es zweifelsohne, wenn sich RNA zukünftig direkt sequenzieren lässt.

 

Andrea Pitzschke

 



Letzte Änderungen: 31.08.2016