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Junge Augenlicht-Retter

(12.12.16) Beim dreizehnten International Genetically Engineered Machine (iGEM)-Wettbewerb in Boston waren deutsche Teams sehr erfolgreich – unter anderem ein Chlamydien-Projekt aus Hamburg. (Mehr zum iGEM-Wettbewerb im aktuellen Laborjournal 12/2016).
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© iGEM Hamburg

Das Projekt des iGEM-Teams von der Uni Hamburg hieß „Finding Chlamydory“. Resultat war ein Mikrofluidik-Chip mit genetisch frisierten Escherichia coli, der Chlamydien in Patientenproben nachweisen soll. Unterstützung bekam das Team von Zoya Ignatova, Leiterin der AG Biochemie und von Robert Blick vom Institut für Nanostrukturen und Festkörperphysik. Beide Profs haben den Studenten unter die Arme gegriffen und ihnen Labore zur Verfügung gestellt.

Im Wettbewerb durften die mehr als 250 iGEM-Teams wie in jedem Jahr auch ihr Lieblingsprojekt wählen. Und dieser Publikumspreis ging an das Hamburger Team. Außerdem brachten die Hanseaten eine Silbermedaille mit nach Hause. Was genau es mit dem Chlamydien-Nachweis-Chip auf sich hat, erklärte uns Team-Mitglied und Master-Student Daniel Cortés.

Laborjournal: Der iGEM-Wettbewerb hat ja was von einer Nachwuchsforscher-WM. Trotzdem gibt es unter den Teams immer wieder Kooperationen. Ihr habt euch mit Teams aus Toulouse und Sydney ausgetauscht, die gar nichts mit eurem Projekt zu tun haben. Und unter allen deutschen Teams gab es ein Kickoff-Meeting, in dem ihr euch gegenseitig Ratschläge gegeben habt. Wie passt das zum Wettbewerbsgedanken? Oder anders gefragt: Im Fußball würde man seine Aufstellung möglichst lange geheim halten und sich nicht mit den Gegnern beratschlagen!

Daniel Cortés: Beim Fußball kann man ja auch schnell eine Aufstellung des Gegners kontern. In der Wissenschaft ist das zum Glück nicht so. Man spezialisiert sich im Projekt ja auf ein bestimmtes Thema; das dauert monatelang, da kann man nicht mal eben etwas abkupfern. Außerdem geht es in der Wissenschaft ja immer um den Austausch von Ideen. Manchmal hat jemand aus einem anderen Team einen Vorschlag, was wir besser machen können. Oder wir können einem anderen Team mit Expertise aus unserem Labor weiterhelfen. 

Also ist es eine Win-Win-Situation.

Cortés: Ganz genau. Und Kollaborationen sind auch ein Kriterium, das für eine Goldmedaille erfüllt sein muss.

Diese Medaillen – Gold, Bronze oder Silber – kann ein Team sich erarbeiten, wenn es im Projekt bestimmte Bedingungen erfüllt und einige zusätzliche Aufgaben im Rahmen des Wettbewerbs meistert. So eine Medaille steht also nicht für einen ersten, zweiten oder dritten Platz, wie man vielleicht meinen könnte.

Cortés: Die Medaillen sind praktisch ein Maß für die Arbeit, die ein Team in das Projekt investiert hat. Dahinter steckt eben auch der Gedanke, dass Teams nicht gegeneinander, sondern miteinander antreten. Das merkt man auch in Boston daran, wie positiv und freundlich die Stimmung ist. Kritik äußert man immer konstruktiv.

Kommen wir jetzt zu eurem Projekt: Ihr habt einen handlichen Chip entwickelt, der Chlamydien in Patientenproben nachweisen soll. Aber es gibt doch bereits Verfahren, um Chlamydieninfektionen nachzuweisen und auch zu therapieren!

Cortés: Hier in Deutschland hört man sehr wenig von Chlamydien. Generell sind die kein großes Problem in Industrieländern, denn hier haben wir Gesundheitsvorsorge und jeder ist krankenversichert. Das heißt, wer hier entsprechende Symptome hat, der geht zum Arzt. Die Diagnostik kostet so zwischen 20 und 120 Dollar. Und wer tatsächlich mit Chlamydien infiziert ist, bekommt eine einzige Antibiotikum-Dosis und ist dann geheilt. Das kommt übrigens recht häufig vor. Statistisch kennst du auch jemanden, der Chlamydien hatte. Man spricht halt nicht darüber, aber Diagnostik und Behandlung sind hier auch kein großes Problem.

Ganz anders in Entwicklungsländern. Da haben die meisten Leute keinen Zugang zu Krankenversicherungen und einer ärztlichen Betreuung. Und für die Chlamydien ist das leider perfekt, um sich zu verbreiten. Die WHO erhebt hierzu Daten, und da sieht man, dass sich Chlamydieninfektionen tendenziell stärker ausbreiten. Die entsprechenden Symptome entwickeln sich oft erst über viele Jahre.


"Wir sprechen nicht von leichten Infektionen" 

 

In eurem Projekt habt ihr euch speziell für Chlamydia trachomatis interessiert.

Cortés: Der Erreger ist namentlich assoziiert mit dem Trachom. Dabei kommt es zu Vernarbungen am Auge, mit Seheinschränkungen bis hin zur Erblindung. Wir sprechen da also nicht von leichten Infektionen.

Du sagst einerseits, dass Chlamydieninfektionen in den Industrieländern kein Problem seien, andererseits, dass sich die Symptome häufig langsam über einen längeren Zeitraum entwickeln. Da müsste es doch auch hier Menschen geben, die die Infektion nicht bemerken.

Cortés: Tatsächlich haben wir es ja auch noch nicht geschafft, Chlamydieninfektionen auszulöschen, eben weil sie oft unter dem Radar fliegen.

Trotzdem erblindet hier niemand.

Cortés: Die Symptome sind zwar anfangs relativ harmlos, aber doch schon so beeinträchtigend, dass die meisten Leute hierzulande zum Arzt gehen. Chlamydien sind sexuell übertragbar, können sich dann aber auch im Körper verbreiten und über Schmierinfektionen ins Auge gelangen, wenn man nicht rechtzeitig therapiert.

Wenn die Diagnostik so teuer ist, warum behandelt man Patienten in Entwicklungsländern dann nicht einfach auf gut Glück mit einem günstigen Antibiotikum, wenn sie die ersten verdächtigen und vielleicht noch harmlosen Symptome zeigen?

Cortés: Prinzipiell wird das genauso gemacht. Doch damit geht eine hohe Fehlerrate einher. Bei einem Sehverlust zum Beispiel weiß man nie genau, ob nicht doch ein Katarakt oder irgendeine andere Augenerkrankung dahintersteckt. Und bevor es wirklich zum Trachom kommt, gibt es eher diffuse Symptome wie Unwohlsein, Rötung, Schwellung, Brennen beim Wasserlassen.

Man riskiert also auch, andere Erkrankungen zu übersehen, wenn man eine Diagnose nicht absichert.

Cortés: Und bis man die klinisch sicheren Zeichen für eine Chlamydieninfektion der Augen hat, ist es praktisch schon zu spät. Weil die starken Symptome oft erst nach langer Zeit auftreten, sind das wiederum ideale Voraussetzungen für die Chlamydien, um sich zu verbreiten. Um das Übel an der Wurzel zu packen, müsste man die Chlamydien erkennen, bevor sie überhaupt zu Symptomen führen. Und dazu brauchen wir billigere Diagnosemethoden. 

 

"Chlamydien sind intrazelluläre Parasiten, das macht es ein bisschen kompliziert" 


Was macht den Nachweis denn so teuer?

Cortés: Chlamydien sind intrazelluläre Parasiten. Das macht es schwerer, dafür Diagnosemethoden zu entwickeln. Wir haben darüber viel mit Experten gesprochen, die bereits Detektionsmethoden entwickelt haben. Die haben uns erklärt, dass es immer darauf ankommt, in welchem Stadium sich die Chlamydien befinden. Ob sie zum Beispiel gerade dabei sind, andere Zellen zu infizieren oder in den Zellen versteckt bleiben. Entsprechend muss man die Patientenproben behandeln und gegebenenfalls auch erst Zellen aufschließen. Das macht es ein bisschen kompliziert.

Eure Methode soll ein Aufschließen der Zellen überflüssig machen. Ihr wollt nämlich die Bakterien über eine bestimmte nicht-proteinogene Aminosäure nachweisen, die die Chlamydien ausscheiden, und die von selbst nach außen diffundiert.

Cortés: Dabei handelt es sich um ein Aminosäure-Derivat, das in Bakterien die verschiedenen Peptidoglycan-Schichten der Zellwand verlinkt: Die 2,6-Diaminopimelinsäure, die wir ‚mDAP’ abkürzen. mDAP ist also ein stabilisierender Bestandteil der Peptidoglycan-Zellwand. Den haben praktisch alle Bakterien, aber das Merkwürdige bei Chlamydien ist, dass sie nur sehr wenig Peptidoglycane haben. Trotzdem verfügen sie über gleich zwei Synthesewege, um dieses mDAP herzustellen. Ein Großteil davon diffundiert nach außen, das ist bei anderen Bakterien nicht so. So kamen wir auf die Idee, mDAP für den Chlamydien-Nachweis zu nutzen.

 
Hamburger iGEM Team "Finding Chlamydory"


Dafür braucht ihr ein Molekül, das spezifisch mit mDAP wechselwirkt.

Cortés: Bei unseren Recherchen haben wir gesehen, dass wir Menschen Toll-ähnliche Rezeptoren haben, die spezifisch gegen Bakterien sind und genau dieses Aminosäure-Derivat angreifen. Dadurch sind wir auf die Idee gekommen, dass wir einen mDAP-Sensor in diagnostischen Bakterien an ein Reportersystem koppeln können – um mDAP zum Beispiel in einem Augenabstrich nachzuweisen.

Als „diagnostische Bakterien“ habt Ihr E. coli umgebaut. Mit welchem Molekül erkennen die mDAP?

Cortés: Wir hatten lange überlegt, den Sensor aus dem menschlichen Immunsystem zu nehmen. Das hat sich als kniffelig herausgestellt, weil es nicht so einfach ist, eukaryotische und prokaryotische Signalwege zu koppeln. Stattdessen haben wir uns später für einen prokaryotischen Aspartat-Sensor entschieden, den wir modifiziert und als Fusionsprotein verwendet haben.

Aspartat ist aber nicht mDAP.

Apartat ist dem mDAP aber strukturell sehr ähnlich. Und über gerichtete Mutagenese konnten wir den Aspartat-Rezeptor Schritt für Schritt so modifizieren, dass die Affinität zum Aspartat verringert und die zum mDAP gesteigert wurde. 

 

"Am Ende hatten wir eine Doppelmutante" 


Wie geht das?

Cortés: Zuerst einmal über bioinformatische Methoden am Rechner. Wir tauschten in einem Computermodell des Rezeptors einzelnen Reste aus und schauten, ob die Affinität sinkt oder steigt. Am Ende landeten wir bei einer Doppelmutante, bei der eine Mutation die Aspartat-Affinität verringerte und die andere die Affinität für mDAP steigerte.

Wie genau dieser Rezeptor in E. coli funktioniert, kann man in eurem iGEM-Wiki nachlesen, wo es auch eine übersichtliche Skizze dazu gibt. Einfach gesagt, habt ihr ein Transmembran-Protein gebastelt – mit einer mDAP-Erkennungsdomäne auf der extrazellulären Seite. Falls mDAP daran bindet, wird über eine Kinase ein Signal ins Zellinnere geleitet, und E. coli exprimiert daraufhin GFP und leuchtet grün.

Cortés: Ja, genau. Und das haben wir dann natürlich auch mittels Fluoreszenzzytometrie überprüft. Dabei gab es ein statistisch signifikantes Ergebnis. Wir hatten also mehr Fluoreszenz, wenn wir E. coli-Bakterien vorher zusammen mDAP inkubiert hatten.

Fluoreszieren die E. colis auch, wenn man sie mit Chlamydien inkubiert? Und fluoreszieren sie mit Chlamydien stärker als mit anderen Bakterien in der Probe?

Cortés: Die Regularien beim iGEM-Wettbewerb geben vor, dass man nur bis zu einer bestimmten Risikoklasse arbeiten darf. Die Chlamydien überschreiten diese Risikoklasse, deswegen konnten wir das nicht testen. Wir haben aber Kollaborationen geschlossen mit anderen Experten, um genau das testen zu lassen. Zeitlich hat das aber nicht mehr geklappt. Das wollen wir demnächst nachholen.

Für ein Diagnose-Tool, das man in Entwicklungsländern vor Ort einsetzen kann, wäre ein Labortest, für den man erst E. coli-Kulturen anrühren muss, ein bisschen unpraktisch. Ihr habt stattdessen einen handlichen Chip entwickelt. Wie funktioniert der?

Cortés: Dazu hatten wir die Nanowissenschaftler mit im Team, die schon relativ früh eine tolle Idee hatten, die diagnostischen Bakterien sicher zu lagern, damit man sie sozusagen auch im Feld einsetzen kann. Uns war wichtig, dass synthetische Biologie eines Tages aus dem Labor mit nach draußen genommen werden kann. Die E. coli-Bakterien haben unsere Nanowissenschaftler in Alginat enkapsuliert. Das ist ein Material mit geringer Porengröße. Mithilfe dieser Kapseln konnten wir unsere diagnostischen Bakterien dann in einen Mikrofluidik-Chip packen, den wir selbst entworfen hatten. Der besteht im Grunde genommen aus drei winzigen Behältern, in denen die Proben landen. Einer ist für die Patientenprobe, die anderen beiden für Negativ- und Positivkontrolle – also je eine Referenzprobe ohne und mit mDAP. Der Augenabstrich eines infizierten Patienten sollte dann eine deutlich höhere Fluoreszenz zeigen als die Negativ-Kontrolle. 

 

E. coli hält sich offenbar gut in Alginatkapseln 


Wie lange überlebt E. coli denn auf einem solchen Chip in den Alginat-Kapseln? Und vermehren sie sich, oder bleibt ihre Zahl konstant?

Cortés: Genau mit dieser Frage verbrachten unsere Nanowissenschaftler einen Großteil ihrer Zeit. Ihre Erkenntnis: Ja, sie überleben. Eventuell vermehren sie sich etwas, aber nicht sehr viel. Und das Lustige ist: Wir hatten tatsächlich relativ früh zu Beginn der experimentellen Phase Bakterien enkapsuliert und vergessen. Die fanden wir Monate später im Kühlschrank und testeten dann einfach mal, ob die noch brauchbar waren. Und siehe da: Sie hatten tatsächlich so lange überlebt. Fazit: Sie halten sich offenbar gut in Alginatkapseln.

Jetzt nehmen wir an, euer Chip funktioniert wie erhofft und kann Chlamydien in Patientenproben recht sicher nachweisen. Du hast anfangs ja die Kosten der Diagnostik angesprochen, und dass Menschen in Entwicklungsländern nicht mal eben 20 Dollar dafür aufbringen können. Wie teuer ist denn euer Chip?

Cortés: Der Preis war ein Kernaspekt unserer experimentellen Prototypen. Damit sind wir momentan bei zehn Cent pro Chip. Wenn man das System tatsächlich als Produkt auf den Markt brächte, könnte man den Preis noch weiter senken, indem man die Herstellung automatisiert.

Ist es realistisch, dass euer Diagnose-Chip Realität werden könnte? Denn viele iGEM-Projekte scheinen ja nach Ende des Wettbewerbs im Sande zu verlaufen.

Cortés: Ein sehr guter Punkt, über den wir in den letzten Wochen viel diskutiert haben. Zum Beispiel haben wir die iGEM-Organisatoren gefragt, ob nicht vielleicht auch Start-ups am Wettbewerb teilnehmen könnten, die dann auch bestimmte Ideen weitertragen und davon profitieren. Das geht momentan noch nicht. Ob die Ideen weitergeführt werden, ist daher von Gruppe zu Gruppe unterschiedlich. Bei uns ist es so, dass unsere Betreuerin Frau Zoya Ignatova sehr motiviert ist. Sie will mit uns dazu eine Publikation schreiben, zumal einige von uns hierzu eine Bachelor-Arbeit machen. Wir hoffen daher sehr, irgendwann wirklich in die Produktphase kommen zu können.

Interview: Mario Rembold



Letzte Änderungen: 14.01.2017

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