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Einzelzell CRISPR-Screen

(25.1.17) Eine Deutsch-Österreichische Gruppe kombinierte die Vorzüge der zwei gängigsten CRISPR-basierten Screening Methoden und entwickelte daraus das CRISPR-Drop-seq-Screening.

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© Paul Datlinger/CeMM

Mit CRISPR-basierten genetischen Screenings versuchen Forscher Schlüsselgene biologischer Prozesse aufzuspüren: Welches Gen ist dafür verantwortlich, dass eine Fähigkeit verloren geht und wie regiert die Zelle, wenn man ein bestimmtes Gen ausschaltet?

Bisher versuchten Wissenschaftler mit zwei unterschiedlichen CRISPR-Strategien Antworten auf diese Fragen zu finden.

Bei der ersten Technik transformierten sie die Zellen nach dem Zufallsprinzip mit einer gRNA-Bibliothek und ermittelten die Verteilung der gRNA vor und nach Ausübung eines Selektionsdrucks. Aus den hieraus erhaltenen gRNA-Sequenzen konnten sie schließlich auf Gene schließen, die für das Überleben der Zellen verantwortlich waren. Diese Strategie funktioniert jedoch nur bei einfachen Readouts die idealerweise Schwarz-Weiß-Antworten (resistent oder nicht) liefern. Will man mit dieser Methode Gene finden, die sich nicht in einfache Schwarz-Weiß-Muster einordnen lassen, wird das Ganze jedoch recht aufwändig.

Die zweite Methode macht sich „Arrayed Screens“ zunutze und liefert komplexe molekulare Readouts. Tatsächlich lässt sich mit ihr der Einfluss einer bestimmten gRNA auf das gesamte Transkriptom einer Zelle, etwa per RNA-seq, ermitteln. Diese Technik ist aber nicht wirklich Hochdurchsatz-tauglich. Wer verschiedene gRNAs testen möchte, muss für jede einzelne eine separate Analyse starten (und braucht hierfür das entsprechende Budget).

Ein Team um den Bioinfomatiker Cristoph Bock vom MPI für Informatik in Saarbrücken sowie Molekularbiologen vom CeMM Wien und der Medizinischen Uni Wien kombinierten in ihrer neu entwickelten CRISPR-Drop-seq oder kurz CROP-seq Technik die Vorzüge der beiden Vorgängermethoden (Nature Methods).

Mit CROP-seq gelang es den Wissenschaftlern, Zellen im Großmaßstab mit einer Vielzahl an gRNAs zu transformieren. In den transformierten Zellen bestimmten sie das Transkriptom und zugleich die Identität und Menge der eingeschleusten gRNA - und zwar auf Einzelzell-Niveau. Ihr Trick besteht darin, gRNAs als „ganz normale“ Transkripte erscheinen und sie dadurch für die Transkriptomanalyse (RNA-seq) identifizier- und quantifizierbar zu machen wie jede andere mRNA.

Bei der klassischen CRISPR-Methode werden gRNAs von RNA-Polymerase III transkribiert. Den Transkripten fehlt also ein PolyA-Schwanz. Gängige RNA-seq-Technologien für Einzelzellanalysen erkennen Transkripte ohne PolyA-Tail jedoch nicht. Für die CROP-seq-Technik gestalteten die Forscher aus Wien und Saarbrücken einen Lentivirus-Vektor geschickt um. Mit dem Ergebnis, dass dieser jede gRNA in zwei Varianten exprimiert: Eine von RNA-Polymerase III erkannte, die ihre normale gRNA-Funktion erfüllt und das Gen-Editing bewirkt. Und eine zweite die in die mRNA eines Resistenzmarkers (Puromycin-Resistenz-Gen) eingebaut ist und von RNA-Polymerase II als Fusionstranskript abgelesen wird. Diese Variante erhält hierdurch automatisch einen PolyA-Schwanz und ist somit für alle auf der PolyA-Anreicherung beruhenden Strategien, etwa RNA-seq, zugänglich.

Fatal wäre es, wenn die gRNA-Insertion im Puromycin-Resistenz-Gen die Menge oder Stabilität des Transkripts beeinflussen würde. Dies konnten die Forscher jedoch ausschließen. Zudem belegten sie mit entsprechenden Experimenten, dass sich die lentiviralen Partikel unbeeindruckt von der gRNA-Insertion ausbilden.

Ein Proof-of-Concept ihrer Strategie liefert das Österreichisch-Deutsche Konsortium anhand der drei Kandidaten-Gene DNMT3B, MBD1 und TET2. In HEK293T-Zellen schalteten sie diese mit den entsprechenden gRNAs aus und generierten stabile Knock-out Zelllinien.

CROP-seq ist bereit für den Einsatz im Großmaßstab: Durch die Transformation Nutzer-definierter lentiviraler gRNA-Bibliotheken erhält man eine Population Genom-editierter Zellen, die für die Einzelzellanalyse prozessiert werden. Über RNA-seq sind sämtliche Transkriptomdaten zugänglich - auch die der gRNA. Die Daten lassen sich mit bioinformatischen Methoden sortieren, um Signaturen zu erkennen. Ergeben Zellen die unterschiedliche gRNAs exprimieren ähnliche Muster, so fungieren die dazugehörigen Gene wahrscheinlich im selben Signalweg.

Wer die Strategie selbst ausprobieren will, erhält das nötige CROP-seq-Guide-Puro-Plasmid über die Plasmid-Bank Addgene.

 

Andrea Pitzschke



Letzte Änderungen: 15.02.2017

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