(1.3.17) Forscher manipulieren die Aktivität von Kinasen meist mit chemischen Substanzen. Präziser und zudem reversibel ist die optogenetische Regulation von Kinasen mit Licht.
Vorlage für Lichtschalter: Fluoreszenzprotein Dronpa
© Thi Nguyen
Kinasen sind Dreh- und Angelpunkt in vielen zellulären Signalleitungswegen. Sie phosphorylieren Proteine innerhalb der Signalkette, zum Beispiel Kinasen oder Transkriptionsfaktoren und leiten das Signal hierdurch weiter. Forscher versuchen Kinasen möglichst punktgenau an- und auszuschalten, um einen Einblick in die Zusammensetzung, Hierarchie und Flexibilität des Informationsflusses zu erhalten. Darüber hinaus sind Kinasen ein beliebtes Ziel therapeutischer Eingriffe, etwa bei Krebs.
Meist setzen Wissenschaftler hierzu chemische Kinase-Inhibitoren ein, die jedoch etliche Nachteile haben: Die Substanzen wirken verzögert, führen häufig zu Nebeneffekten und hemmen die Kinasen oft irreversibel. Eine Gruppe um den Signalweg-Spezialisten Michael Lin von der Stanford Universität entwickelte deshalb eine optogenetische Methode, mit der sich Kinasen punktgenau mit Licht an- und ausschalten lassen (Science).
Optogenetiker konzentrierten sich bisher meist auf Proteine, die von Natur aus dimerisieren und nur als Paar aktiv oder inaktiv sind. Dazu fusionierten sie das jeweilige Zielprotein mit einer Lichtsensordomäne. Wird diese beleuchtet, so dimerisieren die Sensordomänen und stellen den Kontakt zwischen den Zielproteinen her, die hierdurch aktiviert oder inaktiviert werden.
Die meisten Kinasen agieren jedoch „solo“ - der Dimerisierungs-Trick zur Aktivitätskontrolle funktioniert bei ihnen nicht. Um Kinasen dennoch mit Licht steuern zu können, positionierten die Amerikaner je eine Lichtsensordomäne rechts und links des aktiven Zentrums der Kinase MEK1. Die Sensordomänen schmiegen sich im Dunkeln aneinander und blockieren den Zutritt des Substrats an das aktive Zentrum der Kinase und somit die Signalleitung. Fällt Licht auf die Sensordomänen, so dissoziieren sie und geben den Weg für das Substrat frei.
Als Vorlage für den Lichtsensor diente das tetramere, grünfluoreszierende Protein Dronpa. Die Forscher mussten dieses jedoch etwas umbauen: Mithilfe von Mutationen konstruierten sie eine photodissoziierbare, dimere Dronpa-Variante (pdDronpa) die unter blauem Licht (500 nm) dissoziiert und bei violettem Licht (400 nm) wieder dimerisiert. Im Gegensatz zu anderen Lichtsensoren wie LOV2 benötigt pdDronpa für das Einfangen des Lichts kein Chromophor, ist also Co-Faktor-unabhängig.
Mit Strukturmodellierungen schätzten Lins Mitarbeiter die effektivste Position von pdDronpa auf der Kinase ab. Ein pdDronpa-Molekül fusionierten sie anschließend an den N-Terminus von MEK1, ein weiteres an den sogenannten FG-Loop in der Nähe des aktiven Zentrums. Die Aktivität der hieraus resultierenden, mit Licht schaltbaren Kinase psMEK1 untersuchten die Forscher mit Immunoblots. psMEK1 phosphoryliert hierbei das Substrat ERK1, das entstandene phospho-ERK1 lässt sich mit einem entsprechenden Antikörper nachweisen.
Zellen, die psMEK1 exprimierten, zeigten ohne Beleuchtung kaum messbare phospho-ERK1-Signale. Wurden sie jedoch mit blauem Licht bestrahlt, so tauchten die Signale innerhalb von zwei Minuten auf. Offensichtlich dissoziierten die zwei psDronpa-Domänen im Blaulicht, wie von Lins Mitarbeitern geplant, und legten das aktive Zentrum frei. Unter violettem Licht fanden sie wieder zueinander und blockierten die Kinaseaktivität erneut.
Dass die Signalleitung über ERK1 auch in dem synthetischen psMEK1-gesteuerten Signalweg normal weiter verläuft, demonstrierten die Wissenschaftler in C. elegans. Bestrahlten sie transgene Würmer mit Blaulicht, so verdickte sich ihr Ende – eine typische Antwort von C. elegans auf die Induktion des ERK1-Signalwegs.
Die optische Kontrolle funktioniert nicht nur bei MEK1 sondern auch bei weiteren Familienmitgliedern, wie MEK2, MEK5, Raf1 sowie CDK5. Da MEKs und die entsprechenden Kinasekaskaden stark konserviert sind, ist die Methode auch für Pflanzenforscher interessant - der anti-phosphoERK1-Antikörper erkennt schließlich auch aktive Kinasen in Pflanzen.
Andrea Pitzschke