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Nuklease-Skalpell statt Axt

(15.3.17) Die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) ist noch immer der Klassiker für die Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen. Mit der neu entwickelten CUT&RUN-Methode erhält sie jedoch ernsthafte Konkurrenz.

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© Andrew Wright Universität Washington

Die Vorzüge, der von Peter Skene und Steven Henikoff vom Howard Hughes Medical Institute (Seattle, USA) ausgetüftelten Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease, kurz CUT&RUN-Technik (eLife 2017;6:e21856) lassen sich mit einem Apfelbaum (Genom) vor der Ernte vergleichen. Verwertbar sind nur intakte Äpfel (Protein-DNA-Komplex), an denen noch der Stiel (DNA-Fragment) hängt.

ChIP-Gärtner fällen die Bäume mit der Axt, schneiden mit der Astschere wild drauflos und fischen im Geäst-Haufen nach Äpfeln. Dabei geht ein Teil der Ernte kaputt und die mit eingesammelten Zweige (unspezifisches Chromatin) mindern die Qualität.

Der CUT&RUN-Gärtner geht mit mehr Feingefühl vor. Er sucht den Baum im intakten Zustand ab, markiert sich alle Stellen, an denen ein Apfel hängt und erntet diese dann zielgenau mit einem sauberen Schnitt (Nuklease). Der Baum bleibt stehen und es entstehen weder Ernteverluste noch ein störender Hintergrund.

Molekularbiologisch bedeutet dies: Beim ChIP-Verfahren behandelt der Experimentator die Zellen zunächst mit Formaldehyd, um bestehende DNA-Protein-Interaktionen zu vernetzen. Mit Ultraschall schließt er die Zellen anschließend auf, wodurch das Chromatin unregelmäßig zerstückelt wird. Tricky ist hierbei die Dauer der Beschallung – zu kleine oder übergroße Fragmente sind wertlos.

Aus den solubilisierten Proben fischt man dann den gewünschten Transkriptionsfaktor (TF) mit einem entsprechenden Antikörper heraus. Der Antikörper-TF-DNA-Komplex bleibt an einer Matrix (zum Beispiel ProteinA-Beads) hängen, aus der die DNA-Fragmente anschließend abgelöst, präzipitiert und für die Sequenzierung aufbereitet werden.

Das Problem dabei: Die Formaldehyd-vermittelte Fixierung ist nicht immer vollständig oder erzeugt Artefakte. Zudem geht bei der Solubilisierung so manche Partnerschaft zu Bruch. Darüber hinaus können unspezifische DNA-Fragmente das Ergebnis verfälschen.

Mit ihrem CUT&RUN-Verfahren setzen die beiden Amerikaner auf eine gänzlich andere Strategie, bei der die gewünschten DNA-Fragmente aus intakten Zellkernen heraus gefischt werden.

Hierzu isoliert man zunächst (nicht-fixierte!) Zellkerne aus dem Zellextrakt mit Lektin-behafteten magnetischen Beads (Lektin bindet an Strukturen auf der Zellkernoberfläche).

Die gebundenen Zellkerne inkubiert man anschließend in einer Antikörperlösung.

Die Antikörpermoleküle wandern durch die Zellkernporen ins Kerninnere zu ihrem passenden Transkriptionsfaktor beziehungsweise dessen Epitop-Tag. Es folgt eine Behandlung mit einem ProteinA-Micrococcal Nuclease (MNase)-Komplex, der ebenfalls durch die Zellkernporen eintritt und sich an den bereits haftenden Antikörpern festkrallt. Hierbei auftretende Verunreinigungen entfernt man durch entsprechende Waschschritte.

Anschließend aktiviert man die MNase durch die Zugabe von Kalzium-Ionen, worauf sie die DNA links und rechts des gebundenen Antikörpers schneidet. Hierdurch trennt die MNase die Antikörper-gebundenen Transkriptionsfaktoren, inklusive der entsprechenden DNA-Andockstelle, vom restlichen Chromatin.

Die Antikörper-gebundenen Transkriptionsfaktoren diffundieren durch die Zellkernporen hinaus und landen bei der anschließenden Zentrifugation schließlich im Überstand. Die DNA-wird aus dem Überstand isoliert und für die Herstellung der Sequenzierbibliothek verwendet.

Dass ihre Methode astrein funktioniert, zeigten Skene und Henikoff mit Hilfe von Hefezellen, bei denen sie ChIP sowie CUT&RUN gegeneinander antreten ließen. Für die getesteten Transkriptionsfaktoren erhielten sie bei diesen Versuchen übereinstimmende Daten – unerwünschte Hintergrundsignale waren beim CUT&RUN-Verfahren jedoch weitaus schwächer als bei der ChIP-Technik.

CUT&RUN lässt sich mit der nativen ChIP-Sequenzierung verknüpfen und funktioniert auch in anderen eukaryotischen Systemen. Zudem erlaubt die Technik, die Ortskoordinaten von Protein-DNA-Kontaktstellen in situ zu bestimmen (In-situ-Mapping).

Die Kernporen könnten dennoch eine Problemstelle des Verfahrens sein, denn nicht selten bilden Transkriptionsfaktoren größere Komplexe mit anderen Proteinen. Zwar gelangen alle beteiligten Partner (nach der Proteinsynthese) nacheinander in den Kern, doch voluminösen Aggregaten, die sich im Kern bilden, könnte der Rückweg versperrt sein.

Andrea Pitzschke



Letzte Änderungen: 07.04.2017

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