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Günstige Antikörperproduktion in Tabak

(31.5.17) Zwei Wissenschaftlerteams aus Wien und München entwickelten einen Teststreifen für ein Algentoxin. Den hierfür nötigen Antikörper produzierten die Forscher  in Tabakpflanzen.
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© National Oceanic and Atmospheric Administration

Mit dem Algenwachstum in Süßwasser steigt auch dessen Toxinbelastung. Zu den gefährlichsten Toxinen zählen die von Cyanobakterien stammenden Microcystine (MC). Trinkt man mit MC kontaminiertes Wasser oder verzehrt belasteten Fisch so reichert sich das Gift im Organismus an, schädigt unter anderem Leber sowie Niere und bringt die DNA-Replikation durcheinander.

Gegen MC existiert der monoklonale Antikörper MC10E7, der aus Maus-Hybridomzellen gewonnen wird und bereits in der Wasser- und Lebensmittelanalytik eingesetzt wurde. Auch die Sequenz von MC10E7 ist bekannt. Die hohen Kosten Hybridomzell-basierter Expressionssysteme verhindern jedoch den Einsatz des Antikörpers in preisgünstigen Schnelltests. Darüber hinaus sind Hybridom-Kulturen häufig sehr instabil, wodurch ihre Produktivität mit der Zeit nachlässt.

Kennt man die Sequenz der variablen Region, die letztlich die Epitop-Spezifität und Affinität ausmacht, lassen sich mithilfe von Fusionen an schwere Ketten chimäre Antikörper herstellen. Ihre Expression macht in Prokaryoten aufgrund der unzureichenden posttranslationalen Modifikationen jedoch keinen Sinn, in Tierzellen ist sie zu teuer und in Hefe nur fragmentär erforscht.

Bleibt die grüne Alternative: Die Antikörperproduktion, etwa in Tabak ist günstig und auch im großen Maßstab möglich. Zudem sind die Zulassungshürden, insbesondere für nichtpharmazeutische, in Pflanzen exprimierte Proteine, niedrig.

Für den MC-Test isolierten die Mitarbeiter von Eva Stögers Gruppe vom Boku Wien sowie Dietmar Knopps Team von der TU München, aus einer MC10E7-Hybridomzellinie zunächst die RNA und überführte diese mittels reverser Transkription in cDNA (Plant Biotechnol J). Mit einer 5´-RACE-PCR amplifizierte das bayerisch-österreichische Team die 5'-Enden der cDNA. Die erhaltenen Fragmente klonierten die Forscher in E. coli und fischten die in Frage kommenden Kandidaten mittels Kolonie-PCR aus diesen heraus. Als Selektionskriterium für Kandidatenklone galt hierbei: Die aus den translatierten Sequenzen (leichte und schwere Kette) abgeleiteten Peptidmassen-Fingerprints (PMF) mussten zu den PMFs des Muster-Exemplars aus Hybrodomzellen passen.

Die aussichtsreichen Kandidatensequenzen verpackte die Gruppe anschließend in Expressionsvektoren. Hefezellen (Pichia pastoris) erwiesen sich hierbei als Fehlschlag. Im ELISA-Test zeigten die aus Hefen gewonnenen MC-Antikörper nur einen kleinen Bruchteil der Bindefähigkeit des Originals aus der Maus.

Die Forscher hielten sich deshalb nicht lange mit Hefe-Expressionssystemen auf sondern gingen zum Tabak über, bei dem sie jedoch einige Tricks anwendeten.

Das Team nutzte zwar die variable, leichte Kette von MC10E7, knüpfte diese aber an eine fremde schwere Kette aus humanem IgG1-Antikörper, den Tabak exprimiert.

Ein klassischer CaMV 35S-Promoter vermittelte die konstitutive Expression des Konstruktes, dessen Isolation durch ein angehängtes Sekretions-Signalpeptid erleichtert wurde. Agrobakterum tumefaciens diente schließlich als Fähre, welche die Bauanleitung für die transiente Expression des Antikörpers in infiltrierte Tabakblätter einschleuste.

Die Gruppe reicherte die exprimierten Antikörpermoleküle mit einer IgG-Chromatographie an und isolierte letzlich aus einem Kilogramm N. benthamiana Blattmaterial circa 300 Milligramm Antikörper.

In einem ELISA-Test stand der „grüne Antikörper“ hinsichtlich Sensitivität und Spezifität seinem Pendant aus Hyridomazellen in nichts nach. Das Gleiche galt für die Dissoziationskonstanten, welche die Gruppe mittels Oberflächenresonanzspektroskopie ermittelte.

Der auf dem Antikörper basierende Teststreifen für die schnelle Probenanalyse vor Ort beruht auf einem ELISA-ähnlichen Kompetitionsprinzip, das Dietmar Knopps Gruppe schon 2016 in einem anderen Kontext verwendet hatte.

MC wird als Leucin-Arginin-Fusion (MC-LR) zunächst an BSA gebunden und als dünne Linie auf einem Nitrozellulosestreifen immobilisiert. Der MC-Antikörper wird mit einer kolloidalen Goldlösung inkubiert, um ihn mit den Goldpartikeln zu verknüpfen. Kommt das Antikörper-Gold-Kolloid mit einer wässrigen, MC-haltigen Probe in Kontakt, so binden die Toxinmoleküle an den auf den Goldpartikeln immobilisierten MC-Antikörper und blockieren seine Bindestellen. Taucht man den Teststreifen anschließend in diese Mixtur, so binden die Antikörper auch an die MC-Linie auf der Membran. Je höher der Toxingehalt der Testlösung, desto weniger MC-Antikörper mit freien Bindestellen verbleiben jedoch für die Bindung an die MC-Linie, und umso geringer fällt das Farbsignal aus.

Auf diese Weise kann man auf dem Teststreifen mit bloßem Auge MC-Konzentrationen von 100 Nanogramm pro Liter Wasser erkennen, was einem Zehntel des von der WHO vorgegebenen Grenzwerts für Trinkwasser entspricht.

 

Andrea Pizschke



Letzte Änderungen: 28.06.2017

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