Auch wenn der prinzipielle Mechanismus von CRISPR-Systemen entschlüsselt ist und zum Genom-Editieren in allen möglichen Organismen verwendet wird, spielt der Faktor „Zufall“ eine große Rolle. Er schlägt scheinbar unvorhersehbar und unkontrolliert zu und lässt etwa fünfzehn Prozent aller Editier-Reaktionen scheitern. Das kostet Zeit und Nerven, die man sparen könnte, wenn man wüsste, welcher Mechanismus für die Fehlerquote verantwortlich ist.
Ein Team um den Molekularbiologen Bradley J. Merrill von der University of Illinois, Chicago, ist ihm auf die Spur gekommen und entwickelte eine einfache Strategie, ihn zu vermeiden. Für die Fehlersuche verwendete das Team vierzig single guide (sg) RNAs, die zu vierzig verschiedenen codierenden Sequenzen unterschiedlicher Gene passten. Die sgRNAs exprimierte die Gruppe zusammen mit Cas9 in embryonalen Stammzellen aus Mäusen. Nach vier Tagen isolierten die Forscher die genomische DNA aus den Zellen und überprüften die Zielsequenzen mittels targeted deep sequencing auf die gewünschte Insertion oder Deletion (Indel).
Die Mutationsraten schwankten hierbei zwischen 1,5 und 53 Prozent. Viel interessanter aber war die Beobachtung, dass sich die unterschiedlichen sgRNAs bezüglich der Mutationseffizienz in zwei klare Gruppen unterteilen ließen: sgRNAs mit hoher und sgRNAs mit mieser Erfolgsquote. Doch was unterschied die erfolgreichen von den Versager-Sequenzen?
Tatsächlich gab es ein erkennbares (Miss-)Erfolgsmuster, das die Gruppe auch beim Durchforsten publizierter CRISPR-Experiment-Daten fand: Der entscheidende Faktor war die Orientierung der sgRNA. Lagerte sie sich an den von der RNA-Polymerase als Template genutzten Strang an (Template-sgRNA), standen die Erfolgsaussichten für ein Indel wesentlich höher, als wenn sie an den Gegenstrang andockte (nicht-Template-sgRNA).
In beiden Fällen bringt die sgRNA ihre Cas9 huckepack mit. Sitzt das Gespann jedoch auf dem Template-Strang, ist seine Verweildauer um einiges kürzer. Kürzeres Verweilen heißt jedoch höhere Editier-Effizienz. Der limitierende Faktor im CRISPR/Cas9-Verfahren ist nämlich das Abwandern der Cas9-Nuklease von der Schnittstelle. Zu gern bleibt sie, auch nach erfolgtem Doppelstrangbruch, auf der DNA hocken, blockiert hierdurch den Zutritt für zelleigene Reparaturenzyme und verhindert damit die Mutation.
Also schnell weg mit der Couchpotato Cas9 von der Schnittstelle. Dafür gibt es einen einfachen Trick: Der Template-sgRNA/Cas9-Komplex lässt sich durch RNA-Polymerase (RNAP) spezifisch verdrängen. Die RNAP arbeitet sich im Zuge der Transkription bis zur blockierten Stelle vor und schiebt den Nuklease-Komplex von der DNA. Letzterer hat seinen Job (Schnitt) ohnehin getan und sollte sich lieber an das nächste zu editierende DNA-Molekül machen. Tatsächlich steigt die Mutationsrate um den Faktor zwei bis drei, wenn sgRNAs auf Gen-Sequenzen zielen, die aktiv transkribiert werden.
Den Beweis hierfür erbrachte das Team mithilfe von zwanzig sgRNAs (zwölf Template- und acht nicht-Template-sgRNAs), die auf ein mCherry-Gen zielten, das von einem Doxycyclin-induzierbaren Promoter kontrolliert wurde. In Zellen, in denen die mCherry-Expression auf Hochtouren lief, war auch das Genom-Editieren am effizientesten – jedoch nur in Zellen, welche die Template-sgRNA exprimierten.
Ihre Verdrängungs-Hypothese untermauerten Merrill und Co. durch verschiedene Tests mit Template- und nicht-Template-sgRNAs. Bei einem Experiment war zum Beispiel der Zugang von T4-Ligase zur Reparatur eines Antibiotikum-Resistenz-Gens je nach sgRNA-Orientierung frei oder durch Cas9 blockiert. Resistente E. coli-Transformanten tauchten in diesem Versuch nur auf, wenn die Forscher Template-sgRNA einsetzten. Egal, was man an der von Cas9 geschnittenen Genom-Stelle vorhat, gilt also, dass die Nuklease möglichst schnell Platz machen muss.
Für fehlerärmeres, effektiveres CRISPR/Cas9-Editieren empfiehlt sich demnach eine sgRNA, die gegen den Template-Strang gerichtet ist und auf ein transkriptionell aktives Gen zielt. Aus dem Single-turnover-Cas9 wird so ein Multiple-turnover-Enzym. Ergo braucht man weniger Cas9-Moleküle pro Zelle, was wiederum Off-target-Effekte reduziert.
Andrea Pitzschke
Clarke R. et al. (2018): Enhanced bacterial immunity and mammalian genome editing via RNA-polymerase-mediated dislodging of Cas9 from double-strand DNA breaks. Molecular Cell, 71(1):42-55.E8