Die jüngsten technologischen Fortschritte erlauben es Biowissenschaftlern, kleinste RNA-Mengen zu quantifizieren. Dazu wird die RNA mithilfe von reversen Transkriptasen in cDNA umgeschrieben. Leider arbeiten reverse Transkriptasen (RTasen) ziemlich ungenau und unspezifisch, insbesondere bei kleinen Probenmengen. Weniger Fehler und bessere Reaktionsergebnisse versprechen neu entwickelte RTasen mit optimierten Eigenschaften.
Ein Forscherteam um Lukas Valihrach vom Institute of Biotechnology of the Czech Academy of Sciences in Vestec, Tschechien, wollte wissen, ob die neuen RTasen dieses Versprechen auch bei kleinen Probenmengen tatsächlich halten. Mit einem selbst konzipierten Benchmark-Test fühlte die Gruppe elf gängigen RTasen in Einzelzell-Proben sowie Proben mit bis zu hundert Zellen auf den Zahn und bestimmte die Leistungsparameter Reaktionsempfindlichkeit, Genauigkeit, Ausbeute und Reproduzierbarkeit der RT-Reaktion.
Für ihre RT-qPCR-Analysen nutzten die Tschechen standardisierte Spike-RNA, die vom External RNA Control Consortium (ERCC) entwickelt wurde. Ein ERCC-Spike-RNA-Set besteht aus unmarkierten polyadenylierten Transkripten verschiedener Länge (250 bis 2.000 Nukleotide). Unterschiedliche Genexpressions-Level werden durch unterschiedliche Häufigkeiten (Abundanz) der ERCC-Moleküle nachgeahmt. Da die Kopienzahlen bekannt sind, konnten die Forscher mithilfe von DNA-Standards die cDNA-Konzentration exakt bestimmen und daraus die RNA-Konversionsrate berechnen.
Die Reaktionsempfindlichkeit der RTasen beurteilten die Forscher anhand der Rate der positiven RT-qPCR-Reaktionen in ERCC-Assays für niedrige und mittlere Häufigkeit. Da nicht nur die RTase selbst, sondern auch die Primer die Reaktionsempfindlichkeit beeinflussen, setzten die Forscher zwei verschiedene Priming-Strategien ein: Ein konventionelles Primer-Gemisch, das üblicherweise für RT-qPCR-Analysen eingesetzt wird, sowie Oligo(dT)-Primer, die meist für RNA-Seq-Analysen verwendet werden.
Nach den ersten Testreihen stand schnell fest, dass die Primer-Strategie kaum Einfluss auf die Empfindlichkeit der Reaktion hat: Im mittel-häufigen ERCC-Assay mit 88 Molekülen pro reverser Transkription erzielten neun von elf RTasen eine positive Reaktionsrate von mindestens 80 Prozent mit beiden Priming-Strategien. Die mittlere positive Reaktionsrate im ERCC-Assay mit vierfach weniger häufigen RNAs (22 Moleküle pro RT) betrug dagegen nur 30 Prozent. Für die RTasen Maxima H- und SuperScript IV, die sich mit dem RT-Primer-Gemisch mit einer positiven Rate von 90 Prozent an die Spitze setzten, sank die Reaktionssensitivität mit Oligo(dT)-Primern auf etwa 45 Prozent. Erstaunlich war, dass die SuperScript II-RTase, die in einigen RNA-Seq-Protokollen empfohlen wird, mit Oligo(dT)-Primern nur eine etwa zwanzigprozentige positive Rate erreichte.
Ein weiteres wichtiges Kriterium für RT-Assays ist ein zuverlässiges und genaues RT-Ergebnis. Um die Genauigkeit der RTasen über einen weiten Konzentrationsbereich zu beurteilen, trug die Gruppe die RNA-Molekülkonzentration (22 bis 282.000 spezifische ERCC-Spike-in-Kopien pro RT-Reaktion) gegen die mit der qPCR ermittelten cDNA-Konzentration auf. Wie zuvor war das Ergebnis unabhängig von der Primer-Strategie. Zwar nahm die Reproduzierbarkeit des RT-Ergebnisses mit der Template-Konzentration ab. Sie blieb jedoch im Wesentlichen bei beiden Primer-Gemischen präzise, auch auf Einzelzell-Niveau.
Die Reaktionsausbeute, eine der kritischsten Leistungskennzahlen für RT-Experimente, sollte sich im Idealfall hundert Prozent nähern. In der Praxis variiert dieser Wert jedoch stark. Mit der ERCC-Spike-RNA und DNA-Standards quantifizierte das Team die Reaktionsausbeute. Die höchsten cDNA-Synthese-Renditen erzielten die RTasen SuperScript IV und Maxima H-. Das schlechteste Ergebnis lieferte eAMV. Die RT-Primer-Mischung führte bei einigen RTasen zu einer Gesamtausbeute von über hundert Prozent, während der Maximalwert bei Oligo(dT)s 75 Prozent erreichte.
Nachdem die Gruppe die Gesamt-Performance der RTasen mittels z-Wert-Statistik ermittelt hatte, standen die Sieger fest: Bei Einzelzell-Anwendungen lagen Maxima H- and SuperScript IV ganz klar vorne, während eAMV und SuperScript II hierfür am wenigsten geeignet waren.
Um die RTasen auch unter realen Bedingungen in einem routinemäßigen Hochdurchsatz-Einzelzell-RT-qPCR-Experiment zu validieren, wählten die Forscher den Testsieger Maxima H- und die schlecht abschneidende SuperScript II als Kandidaten aus. Als Einzelzell-Proben verwendeten sie FACS-sortierte Astrozyten aus gesunden Maushirnen und ALS-Maushirnen. Die Daten wertete das Team hinsichtlich positiver Reaktionsrate, Expressions-Level und Cluster-Bildung aus. Das Ergebnis bestätigte die Resultate, die zuvor mit den synthetischen RNA-Templates erzielt wurden: Die leistungsstärkere RTase lieferte eine höhere positive Rate sowie stärkere Signale. Zudem führte sie zu einer besseren Trennung zwischen den zwei Zellpopulationen.
Die tschechische Studie zeigt, dass die Leistungsfähigkeit und Reproduzierbarkeit von RTasen sehr unterschiedlich ist. Die Ergebnisse verdeutlichen aber auch einen Zusammenhang zwischen der Performance bestimmter RTasen und ihren biochemischen Eigenschaften. Die leistungsfähigsten RTasen SuperScript IV und Maxima H- sind thermostabil. Die hierdurch mögliche höhere Reaktionstemperatur führt zur Destabilisierung sekundärer RNA-Strukturen und damit zu einer häufigeren Primer-Hybridisierung, woraus letztlich eine stabile reverse Transkription resultiert.
Miriam Colindres
Zucha D. et al. (2019): Performance comparison of reverse transcriptases for single-cell studies. bioRxiv, DOI: 10.1101/629097