Wer verschiedenen Zelltypen in 3D-Zellkulturen einen definierten Platz zuweisen oder Zellen positionsgenau über Kanäle mit Wirkstoffen und Nährlösungen versorgen will, baut den Zellen mit Hydrogelen ein geeignetes dreidimensionales Gerüst. Die hierzu verwendeten Verfahren wie Photopolymerisation, 3D-Druck oder Mikroextrusion sind aber ziemlich rabiat und fordern unter den Zellen viele Opfer, etwa durch Photo-Initiatoren oder Scherkräfte.
Es geht aber auch sanfter. Die Gruppe des Bioingenieurs Erwin Berthier von der University of Washington in Seattle baut die Gerüste aus Agarose-Hydrogelen, indem sie Schicht um Schicht aufeinanderlegt und sich dabei zwei physikalische Prinzipien zunutze machen: Oberflächenspannung und Kapillarkraft.
Um den Baufortschritt besser verfolgen und die einzelnen Schichten unterscheiden zu können, färben die Forscher ihre Hydrogele mit diversen Lebensmittelfarben. Die noch flüssige Agaroselösung speisen sie mithilfe einer Pipette in einen flachen Hohlraum ein, worauf sie sich von selbst entlang der vorgegebenen Grenzen ausbreitet. Den Hohlraum definiert eine flache Schablone, die an ihrer Unterseite wunschgemäße Aussparungen enthält und an der Oberseite bis auf ein kleines Loch zum Gel-Einfüllen geschlossen ist. Die Schablone wird mit Abstandhaltern über den Boden einer Multi-Well-Platte gelegt.
Egal, wie kompliziert das Muster der Aussparungen ist - durch Kapillarkraft wird es von der oben eingefüllten Flüssigkeit ausgefüllt. Man kann sich das ungefähr so vorstellen, als drücke man einen Stempel auf ein Papier und fülle von oben durch ein Loch im Griff Tinte ein. Wo der Stempel direkt aufliegt, bleibt das Papier weiß. Alle anderen Stellen füllen sich mit Tinte. Statt Tinte verwendet man Low-melting-Agarose, die schon bei Temperaturen flüssig wird, die für Zellen noch akzeptabel sind. Kühlt sie ab und erstarrt, schafft sie die Basis für die nächste Schicht. Mehrere Dutzend Schichten von 100 bis 500 Mikrometern Dicke können so sukzessive aufeinander getürmt werden.
Mit jeder hinzukommenden Schicht wird der Abstandhalter zwischen dem Boden der Petrischalen und der Schablone entsprechend erhöht. Da jede Schicht separat pipettiert wird, können sie auch verschiedene Hydrogel-Kompositionen enthalten, zum Beispiel Agarose mit unterschiedlicher Konzentration oder mit verschiedenen Zelltypen.
Die US-Amerikaner testeten das Hydrogel an fötalen Lungen-Fibroblasten, die in Kollagen eingebettet waren und mehrschichtig in eine Agarose-Hydrogel-Umgebung eingearbeitet wurden. 87 Prozent der Zellen hielten das Prozedere durch. Im Gegensatz zu den Vorgänger-Methoden wird nur so viel Lösung verbraucht, wie tatsächlich in dem fertigen Gebilde landet. Gerade für knapp verfügbare Zellen wie Primärzellen von Patienten ist diese Materialeffizienz entscheidend.
Komplizierte Strukturen lassen sich mit einer einfachen Schablone herstellen. Die sieht mitunter so unspektakulär aus wie ein Hemdknopf und besteht nur aus einer runden Scheibe mit zwei Löchern. Dreht man die Schablone mit jeder Schicht um ein paar Grad weiter, so wächst ein Gebilde mit zwei vertikalen, umeinander gewundenen Kanälen heran. Sind in der Hydrogel-Bausubstanz Zellen eingebettet, kann man über die Kanäle zum Beispiel Wirkstoffe applizieren, die man an den Zellen testen möchte.
Die Schablonen selbst bestehen aus Harz und stammen aus dem 3D-Drucker. Wer Hydrophilie und Hydrophobie geschickt nutzt, kann sich die Harzschablonen aber auch schenken. Dazu klebt man eine Plasma-behandelte Polystyrol-Folie in Form des gewünschten Musters ab, welches das Hydrogel einnehmen soll. Anschließend besprüht man die Folienoberfläche mit einem Imprägnierspray und entfernt danach das Klebeband. Zurück bleibt eine Folie, die an ausgewählten Stellen hydrophob beziehungsweise hydrophil ist. Jetzt legt man eine zweite unbehandelte Folie auf die erste Folie, mit Deckgläschen als Abstandhalter und pipettiert ein Hydrogel in den hauchdünnen Zwischenraum. Das Hydrogel rutscht über die hydrophoben Stellen hinweg und füllt ausschließlich die einst abgeklebte hydrophile Zone.
Auch mit diesem Verfahren kann man mehrere Schichten übereinander legen. Hierzu klebt man erneut ab, sprüht wieder und erhöht die Abstandhalter schließlich um eine Lage Deckgläschen.
Anwendungen des Schicht-für-Schicht-Verfahrens sehen seine Erfinder zum Beispiel im Bau von 3D-Organoid-Modellen, da die Anordnung von Zelltypen, Kultivierungsmedium und Matrixmaterial strikt kontrolliert werden kann. Kanalartige Aussparungen in 3D-Gebilden schaffen Raum für Mikrofluidik-Anwendungen, beispielsweise zur Applikation von Wirkstoffen.
Andrea Pitzschke
Lee U. et al. (2019): Layer-by-Layer of 3D hydrogel structures using open microfluidics. BioRxiv, DOI: 10.1101/687251