Wer schon einmal eine Suspension adhärent wachsender Zellen in einer Petrischale oder einer Multi-Well-Platte auf einem horizontalen Schüttler inkubiert hat, kennt das Phänomen: Eigentlich sollte die kreisförmige Bewegung die Zellen schön gleichmäßig im Medium verteilen und immer wieder sanft verwirbeln. Doch in Wirklichkeit setzen sich die Zellen nicht gleichmäßig auf dem Boden des Kulturgefäßes ab, sondern bevorzugt in dessen Mitte. Gleichverteilung? Fehlanzeige! Die sich im Zentrum absetzenden Zellen werden allmählich von weiteren Zellschichten überlagert, wodurch sich ihre Wachstumsbedingungen verändern – was wiederum Experimente mit den Zellkulturen verfälschen kann.
Einsteins Teetasse
Die Konzentration der Zellen im Zentrum des Kulturschalen-Bodens ist auf den sogenannten Teeblatt- oder Teetassen-Effekt zurückzuführen, dessen physikalische Grundlagen Albert Einstein 1926 als Erster beschrieb (Die Naturwissenschaften, 14, 223-24). Teeblätter in einer umgerührten Tasse bewegen sich, genauso wie suspendierte Zellen auf einem Horizontalschüttler, nicht nur in der horizontalen, kreisförmigen Hauptströmung sondern auch in einer quer zu dieser verlaufenden Sekundärströmung, die in Richtung des Zylindermittelpunkts verläuft. Beim Rühren steigen die Wasserteilchen in der Mitte des Gefäßes mit der Sekundärströmung nach oben und wandern am Gefäßrand wieder nach unten. Zellen oder Teeblätter sind aber zu schwer und machen den Aufstieg nicht mit. Ihre Reise endet damit in der Mitte auf dem Boden des Gefäßes.
Eine Gruppe um den Reproduktionsmediziner Clifford Librach von der University of Toronto fand eine sehr simple Lösung, mit der sich die lästige Sekundärströmung ausbremsen lässt. Librachs Mitarbeiter platzierten einen vertikalen Zylinder aus Polypropylen mit einem Durchmesser von sieben Millimetern in der Mitte der verwendeten 35-Millimeter Kulturschalen. Als Kleber für den Zylinder verwendete die Gruppe ein biologisch inertes Silikonfett, das sie auf den Schalenboden auftrugen.
Gegen die Wand
Damit war der Zielpunkt der ungewollten Sedimentation besetzt. Von oben betrachtet bildet das Gefäß mit dem zylindrischen Insert zwei konzentrische Kreise. Beim Schütteln stoßen die Zellen nicht nur an die eigentliche Gefäßwand, sondern auch an die Wand des Innenzylinders. Die Gruppe vermutete, dass dies zu einer Gleichverteilung der Zellen in der Kulturschale führen sollte. Vorversuche mit Silikon-Kügelchen anstelle von Zellen bestätigten diese Hypothese.
Anschließend kultivierte das Team verschiedene adhärente Zellen (immortalisierte Zelllinien aus Mensch und Maus) in den Platten mit den zylindrischen Inserts und verglich die Ergebnisse mit der Kultur in Standardgefäßen. Während sich die Zellen in den üblichen Kulturschalen im Zentrum des Gefäßbodens konzentrierten, verteilten sie sich in den Schalen mit Zylinder gleichmäßig auf dem Schalenboden.
Lebendzell-Zählungen ergaben, dass sich die Ausbeute lebender Zellen durch die zusätzlichen Innenzylinder bei den getesteten Zellsystemen (Choriokarzinom-Zelllinien JEG-3 und BeWo) verdoppelte. Zudem wies die Gruppe mithilfe von Durchflusszytometrie-Experimenten nach, dass die Lage der Zellen an der Peripherie oder näher am Zentrum die Expression der Oberflächenmarker-Proteine CD90 und CD105 nicht beeinflusste. Ganz im Gegensatz zu Zellen, die in Standardschalen kultiviert wurden. In diesen hing die Expression von CD90 sowie CD105 sehr deutlich von der Position der Zelle ab.
Auch interessant für Stammzell- und Pflanzenforscher
Von den zylindrischen Inserts können auch Stammzellforscher profitieren. Die oft als Fütterzellen (Feeder layer) für Stammzellen genutzten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) formieren sich ebenfalls sehr homogen auf den Platten. Der Feeder-Zellrasen gibt den Wachstumsfaktor IGF-1 an allen Stellen gleichmäßig ab und schafft so perfekte Zuchtbedingungen. Ähnliches sollte auch für pflanzliche Protoplasten gelten, die man häufig auf einem Nährrasen aus Reis- oder Bananenzellen züchtet.
Andrea Pitzschke
Szaraz P. et al. (2019): A solution to prevent secondary flow in adherent cell cultures. Biology Open, 2019 8: bio045294