Info

Kein Serum – keine Fluoreszenz

(04.12.2019) Viele Fluoreszenz-Farbstoffe fühlen sich in serum­freien Medien nicht sonderlich wohl. Proble­matisch ist dies bei Zyto­metrie-Experimenten.
editorial_bild

Info

Info

Lernen Sie die neue Transferpette® S kennen und sichern Sie sich jetzt Ihr kostenloses Testgerät. mehr

Um Zellen unter möglichst reprodu­zierbaren Bedin­gungen zu kulti­vieren, verwenden viele Forscher chemisch definierte, serum­freie Medien. Wie sich die Serum-Formu­lierungen auf die Stabilität von Fluo­reszenz-Farb­stoffen auswirken, die zum Beispiel in Fluo­reszenz-gelabelten Anti­körpern für Durch­flusszyto­metrie-Experi­mente einge­setzt werden, wurde aber bisher nicht weiter untersucht.

Ein Team um den Immuno­logen Daniel Campbell von der University of Washington School of Medicine in Seattle hat dies nach­geholt und kam zu beun­ruhigenden Ergebnissen. Die Forscher markierten für ihre Experi­mente zunächst CDF+-T-Zellen mit Fluo­reszenz-gelabelten Anti­körpern und resus­pendierten diese in einem serum­freien Medium für hämato­poetische Zellen. Anschlie­ßend maßen sie die Fluo­reszenz der markierten T-Zellen sofort im Dunkeln und nach einer fünf­minütigen Beleuch­tung in der Injektions­kammer eines Cell Sorters mit LED-Licht. Zwei der verwen­deten Farb­stoffe (CD45RA-AlexaFluor700 und CD127-PE/Cy7) wiesen nach der Beleuch­tung nur noch ein Zehntel ihrer ursprüng­lichen Fluo­reszenz-Intensität auf.

Info

Info

Pipettieren, lagern und zentrifugieren Sie Proben in unserem Spiel "Master of Volumes" so schnell wie möglich. mehr

Puffer mit und ohne Serum

Um der Sache weiter auf den Grund zu gehen, labelten Campbells Mitarbeiter mono­nukleäre Zellen des peri­pheren Blutes (PBMC) mit CD4-AF488 und dem Tandem­farbstoff CCR6-PE/Cy7. Bei Letzterem agiert PE beim Förster-Resonanz-Energie-Transfer als Donor­farbstoff, der seine Energie auf den Akzeptor Cy7 überträgt. Danach resus­pendierten sie die Zellen entweder in einem Färbe­puffer, der Kälber­serum enthielt, oder in verschie­denen serum­freien Medien und maßen anschlie­ßend die Fluo­reszenz-Inten­sität im Dunkeln. Zusätz­lich bestimmte die Gruppe auch das soge­nannte Spillover-Signal im PE-Detektor. Dieses tritt auf, wenn PE die Energie nicht auf Cy7 überträgt und sie als Fluo­reszenz-Signal im PE-Detektor landet. Ähnlich wie beim ersten Experi­ment, wurde die Fluo­reszenz-Inten­sität sowie das Spillover-Signal sofort im Dunkeln und nach einer einstün­digen Beleuch­tung mit einer Fluoreszenz­lampe gemessen.

Auch in diesem Fall war das Ergebnis eindeutig: Wurden die markierten PBMC-Zellen in serum­haltigem Puffer suspendiert, veränderten sich nach der einstün­digen Beleuch­tung weder die Fluo­reszenz-Inten­sität noch die Stärke des Spillover-Signals. Im serum­freien Medium dagegen verringerte sich die Fluo­reszenz-Inten­sität und das Spillover-Signal nahm in einigen der verwen­deten Medien deutlich zu.

Info

Info

Bestellen Sie noch heute Ihr kostenfreies Exemplar. mehr

Serum schützt oder stabilisiert

Theoretisch gibt es zwei Gründe, warum Fluo­reszenz-Farb­stoffe im serum­freien Medium einen großen Teil ihrer Inten­sität einbüßen: Die Zellen sterben mangels Schutz oder Kompen­sation durch das Serum. Oder das Serum hat stabili­sierende Eigen­schaften, die Fluo­reszenz-Farbstoffe vor Schäden durch Licht bewahren.

Um zwischen den zwei Möglich­keiten zu unter­scheiden, verwen­deten die Forscher Fluo­reszenz-Farb­stoff-markierte Kügelchen (Beads) anstelle von Zellen und unter­zogen diese der gleichen Beleuch­tungs- und Analyse­prozedur. Auch hier schwand die Inten­sität der Fluo­reszenz-Farb­stoffe im serum­freien Medium: Der Zerfall der Farb­stoffe tritt demnach unab­hängig von den Zellen auf.

Auf der Suche nach einer Substanz, die den Farb­stoff-Zerfall im serum­freien Medium aufhalten könnte, fiel Campbells Gruppe Vitamin C als möglicher Retter ein. Und tatsäch­lich reduzierte zuge­setztes Vitamin C (1 mM), zumindest in einem Teil der einge­setzten serum­freien Medien, den Verlust der Fluo­reszenz-Inten­sität. Aber auch Vitamin C ist keine wirkliche Lösung des Problems: Es beein­flusst unter anderem den Stoff­wechsel von Zellen und verfälscht dadurch Ergeb­nisse. Campbell und sein Team geben deshalb den einfachen Rat, bei Zyto­metrie-Experi­menten die Finger von serum­freien Medien zu lassen.

Andrea Pitzschke

Morawski P. et al. (2019): Rapid light-dependent degradation of fluorescent dyes in formulated serum-free media. BioRxiv, DOI: 10.1101/578856



Info

Info

Die innovativen Pipettier­lösungen der Firma INTEGRA Biosciences sind der perfekte Partner für magne­tische Reinigungs­verfahren mehr

Info

Info

Die NEB Versandbox mit Stroh-Pads ist ressourcenschonend & hat die gleiche Isolierleistung wie Styroporboxen. mehr



Letzte Änderungen: 04.12.2019

Diese Website benutzt Cookies. Wenn SIe unsere Website benutzen, stimmen SIe damit unserer Nutzung von Cookies zu. Zur ausführlichen Datenschutzinformation