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Zentrifugation spart Zeit

(15.01.2020) Mit einer simplen Zentrifugations-Technik lassen sich im Schnelldurchlauf Aptamere isolieren, die spezifisch an Oberflächen von Mikroorganismen binden.
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Die Vielfalt von Mikroorganismen ist immens. Allein in den etwa zwei Kilogramm des menschlichen Mikrobioms tummeln sich Hunderte verschiedener Spezies. Für Krankheitsdiagnosen oder Analysen von Lebensmittelproben ist es aber erforderlich, Bakterien oder Pilze schnell und zweifelsfrei zu identifizieren. Zwar gibt es für die üblichen Verdächtigen spezifische Antikörper und es werden fortwährend neue Antikörper entwickelt. Doch das dauert. Zudem ist es völlig aussichtslos, Antikörper gegen jeden einzelnen Mikroorganismus zu entwickeln.

Jede Bakterien-Spezies trägt aber Strukturen auf der Oberfläche, die von spezifischen Rezeptoren erkannt werden. Zu letzteren zählen auch Aptamere. Diese bestehen aus einzelsträngigen DNA- oder RNA-Fragmenten mit einer dreidimensionalen Struktur, die entsprechende Zielmoleküle erkennen. Mit dem SELEX-Verfahren (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) kann man systematisch gewünschte Aptamere anreichern. Dazu bietet man dem Target, das zum Beispiel aus der Oberflächen-Struktur eines Bakteriums besteht, abertausende zufällig entstandener Aptamere an und reichert diejenigen sukzessive an, die an das Zielmolekül binden.

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Bis zu 30 Anreicherungsrunden

Der SELEX-Prozess erfordert jedoch viel Geduld, da immer wieder das gleiche fünfstufige Protokoll durchlaufen wird: Das aus einer DNA-Zufalls-Bibliothek bestehende Aptamer-Gemisch wird zunächst mit dem gewünschten Mikroorganismus inkubiert. Anschließend werden nicht-gebundene Aptamere in einem Waschschritt entfernt. Die verbliebenen Aptamere werden danach eluiert, amplifiziert, vom PCR-Gemisch abgetrennt und den frischen Proben des Mikroorganismus erneut angeboten. Sieben bis dreißig Anreicherungsrunden sind meist nötig, bis der im letzten Schritt gewonnene Aptamer-Kandidat endlich kloniert und sequenziert werden kann. Eine Gruppe um Byoung Chan Kim vom Korea Institute of Science and Technology in Seoul hat eine verblüffend simple Alternative zu SELEX gefunden, die wesentlich schneller und mit weniger Aufwand zu vergleichbaren Ergebnissen führt.

Auch bei dem koreanischen Verfahren werden die vielversprechendsten Aptamere sukzessive über mehrere Anreicherungszyklen herausgefiltert. Nur ist ein Zyklus ungleich kürzer als bei der klassischen SELEX-Technik. Los geht‘s mit der Inkubation des hitzedenaturierten Aptamergemischs mit dem Zielorganismus, im konkreten Fall E. coli, in einem Bindepuffer aus 1x PBS; 0,1 mg/ml Lachsspermien-DNA; 1% BSA sowie 0,05% Tween-20.

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Zehnmal zentrifugiert

Bei der anschließenden Zentrifugation der Bakterienkultur für fünf bis zehn Minuten bei 13.000 RPM landen nicht-gebundene Aptamere im Überstand. Das Zellpellet wird anschließend mithilfe eines Vortexers gründlich resuspendiert, erneut gewaschen und zentrifugiert. Dieser Zyklus wird zehnmal wiederholt, ohne die Bedingungen zu verändern.

Die auf der Bakterienoberfläche haftenden Aptamere werden danach auf 95°C erhitzt, um sie zu denaturieren und von der Oberfläche zu lösen. Anschließend kommen sie in die zweite Auswahlrunde, in der sie ihre Spezifität zum Zielorganismus unter Beweis stellen müssen. Dazu wird das Aptamer-Gemisch für eine Stunde mit fremden Organismen inkubiert, im vorliegenden Fall waren dies B. subtilis und vier weitere Bakterienarten. Aptamere, die an diese binden, sind als E.-coli-spezifische Bindepartner ungeeignet.

Das Inkubationsgemisch wird zentrifugiert und der Überstand mit frischen E.-coli-Zellen inkubiert. Auch hier durchlaufen die Aptamere zehn Zyklen aus Binden, Zentrifugieren, Waschen und erneutem Inkubieren. Das nach der Erhitzung gewonnene Eluat muss danach nur noch filtriert werden, um BSA, Lachsspermien-DNA und Zellbruchstücke loszuwerden.

In sieben Stunden erledigt

Da die DNA-Zufallssequenzen beidseitig von bekannten Primer-Bindestellen flankiert sind, können die Aptamere mithilfe einer PCR amplifiziert und kloniert werden. Statt sieben bis dreißig PCRs, wie bei SELEX, ist bei der koreanischen Variante nur eine einzige Amplifikation nötig. Der Weg bis dorthin dauert etwa sieben Stunden.

Kims Mitarbeiter fanden mit der neuen Technik zehn E.-coli-spezifische Aptamer-Kandidaten. Anders als beim SELEX-Verfahren wiesen ihre Sequenzen keine Muster oder konservierte Abschnitte auf. Die ermittelten Dissoziationskonstanten waren bei beiden Verfahren etwa gleich.

Mithilfe von 3‘-FAM-Farbmarkierungen verfolgten die Koreaner, wie die Konzentration ungebundener Aptamer-Kandidaten im Zuge der Waschzyklen sukzessive abnahm. Mit dieser Technik fanden sie auch heraus, dass die nach den ersten zehn Zyklen isolierte Aptamer-Ppopulation nur mit etwa einem Viertel der ursprünglichen Stärke in der zweiten Runde an die fremden Bakterien band.

Andrea Pitzschke

Kim H. et al. (2019): Rapid isolation of bacteria-specific aptamers with a non-SELEX-based method. Analytical Biochemistry, 591:113542

Foto: UCL Mathematical & Physical Sciences







Letzte Änderungen: 15.01.2020

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