Können Mikroorganismen beim Abbau von Plastik und Mikroplastik helfen? Dieser Frage gehen wir in einem Hintergrundartikel aus dem Dezember-Heft nach. 2016 hatten japanische Forscher ein Enzym im Bakterium Ideonella sakaiensis entdeckt, das auf den Abbau von PET spezialisiert ist (Science, 351:1196-9). Ein zweites Enzym dieses Bakteriums spaltet außerdem das beim PET-Abbau entstehende Monomer MHET weiter auf. Seither interessieren sich Mikrobiologen und Chemiker für die PETase (siehe auch unser Stichwort des Monats zum Thema) und die MHETase und suchen nach Wegen, beide Enzyme zu optimieren und in andere Organismen einzubringen.
Auch Studierende an der TU Kaiserslautern haben mit den beiden Enzymen aus Ideonella gearbeitet; sie brachten die Gensequenzen in Chlamydomonas reinhardtii ein. Die einzellige Grünalge ist nun in der Lage, PET zu zersetzen. Das Projekt mit dem geschmackvollen Namen „Chlamy Yummy" hat dem Team beim iGEM-Wettbewerb in Boston 2019 den dritten Platz bei den „Undergrads“ eingebracht – der Kategorie für Bachelor-Studenten. Außerdem nahm das Team vier Sonderpreise mit nach Hause. Lukas Punstein ist einer der Jungforscher aus dem iGEM-Team der TU-Kaiserslautern.
Laborjournal: Mit Chlamy Yummy habt ihr im Sommer 2019 per Crowdfunding nach Unterstützern gesucht. Dabei sind mehr als 12.000 Euro zusammengekommen. Warum war finanzieller Support so wichtig?
Lukas Punstein: Der Grund war einfach, dass wir uns selbst um die Finanzierung unseres Projekts kümmern mussten. Zum einen ging es um die Laborarbeit mit Labormaterialien und Chemikalien, zum anderen aber auch um die Öffentlichkeitsarbeit samt Flyern, Plakaten und Handzetteln. Außerdem gab es im Vorfeld insgesamt fünf iGEM-Meetups. Dafür fielen Gebühren an. Dann der Flug nach Boston und dort die Unterkunft. Allein die Registrierung für iGEM betrug 4.500 US-Dollar. Hinzu kam noch eine Konferenzgebühr von 750 US-Dollar pro Person.
Hat sich auch eure Uni an den Kosten beteiligt?
Punstein: Ja, wir sind auch von der Uni finanziell unterstützt worden; und über BioComp, eine Förderinitiative des Landes Rheinland-Pfalz. Das allein reichte aber nicht, so dass wir uns, wie bei iGEM üblich, auch selber um Sponsoren für unser Projekt kümmern mussten. Da kamen wir dann auch auf das Thema Crowdfunding. Hierzu hat uns das Gründungsbüro unserer Uni viele Tipps gegeben.
Nun habt ihr zwei Gene aus Ideonella in Chlamydomonas eingebracht, nämlich die PETase und die MHETase. Wie kamt ihr ausgerechnet auf diese Alge als Organismus für euer Projekt?
Punstein: Wir haben gesehen, dass seit 2016 schon in mehreren iGEM-Projekten mit diesen beiden Enzymen gearbeitet wurde. Allerdings immer in Bakterien. Dabei trat unter anderem regelmäßig das Problem auf, dass Bakterien einen Biofilm bilden. Das erschwert die Sekretion der Enzyme nach außen. Wir wollten deswegen einen Eukaryoten verwenden, der frei im Wasser schwimmt. Da bietet sich Chlamydomonas aus mehreren Gründen an: Es finden posttranslationale Modifikationen am Protein statt, die zu einer höheren Protein-Stabilität führen. Die Alge hat ein bestehendes Sekretionssystem. Und nicht zuletzt: Michael Schroda, einer der drei Professoren, die unser Projekt betreut haben, arbeitet seit vielen Jahren mit Chlamydomonas. Sein Labor hat dazu schon etliche Methoden etabliert, so dass wir direkt loslegen konnten.
Zur iGEM-Philosophie gehört ja auch, dass die Teilnehmer ihre Protokolle und Materialien für nachfolgende Teams zugänglich machen. Gab es für die PETase und die MHETase schon fertige „BioBricks“ der vorherigen Jahrgänge, auf die ihr zurückgreifen konntet?
Punstein: In dem Fall konnten wir nicht auf die iGEM-Library zurückgreifen, weil Chlamydomonas als Eukaryot andere Codons verwendet und für effiziente Genexpression Introne benötigt. Die anderen iGEM-Teams hatten ja mit Bakterien gearbeitet. Wir haben also selber die Basenfolgen für Chlamydomonas optimiert und bei einer Firma synthetisieren lassen. Ausprobiert haben wir verschiedene Varianten, um eine möglichst hohe Effizienz beim Plastikabbau zu erzielen.
Konntet ihr das Enzym dadurch verbessern?
Punstein: Jein. PET kann in zwei Abbauprodukte zersetzt werden: MHET und BHET. Und BHET lässt sich ebenfalls zu MHET abbauen. Für unsere PETase haben wir eine gute Aktivität gegen BHET zeigen können. Gegen PET selbst haben wir bisher aber nur eine sehr geringe Aktivität gemessen.
Also PET-Flaschen können eure Algen bislang nicht abbauen?
Punstein: Beim PET aus dem Supermarkt wäre der kristalline Anteil viel zu hoch, da hätte die PETase praktisch keine Chance. In unseren Experimenten haben wir daher mit einem speziellen PET-Film gearbeitet, bei dem der amorphe Anteil höher war als der kristalline.
Bei der Recherche zu unserem Hintergrundartikel zum Plastikabbau haben wir auch von anderen Forschern gehört, dass diese Enzyme eine bislang noch viel zu geringe Aktivität haben, um praxistauglich zu sein. Insofern sind all diese Arbeiten wohl nur Proof-of-Concept-Studien, oder?
Punstein: Zumindest im aktuellen Stadium funktioniert das noch nicht wirklich gut.
Die Marburger Arbeitsgruppen um Daniel Moog und Uwe Maier haben die PETase ebenfalls in einem Eukaryoten exprimiert, nämlich in einer Kieselalge (Microb Cell Fact, 18(1):171). Das Projekt ist eurem ja sehr ähnlich – gab es da einen Austausch?
Punstein: Ja, ein Teamkollege hatte viel Kontakt gehabt mit Daniel Moog. Leider kann man nicht alles einfach für Chlamydomonas übernehmen. Zum Beispiel haben wir andere Mutationen in die PETase eingebaut. Und dann wollten wir ja zusätzlich auch die MHETase einbringen, denn unsere Algen sollten auch das entstandene MHET weiter abbauen können.
Was war die härteste Nuss, die ihr zu knacken hattet?
Punstein: Es hat eine ganze Weile gebraucht, bis es uns gelungen ist, beide Enzyme zu sekretieren. Wir haben nicht gedacht, dass das so ein Problem wird. Die Expression funktionierte, und für die MHETase haben wir es auch schnell hinbekommen, dass sie aus der Zelle herauskommt. Aber die PETase blieb im Endoplasmatischen Retikulum hängen. Das mussten wir aber erstmal herausfinden, und da haben wir viel Zeit damit verbracht, alternative Sekretionssignale auszuprobieren. Die PETase wirklich zu sekretieren, das war sicher eines der langwierigsten und härtesten Herausforderungen im Projekt.
Du hast schon erwähnt, dass ihr Betreuer hattet; so ist es bei iGEM ja üblich. Nun stelle ich es mir nicht immer einfach vor, dabei die Waage zu halten: Also zum einen, dass ihr als Team eure eigenen Ideen entwickelt und selbständig seid, zum anderen aber, dass ihr euch trotzdem nicht alleingelassen fühlt, wenn ihr mal auf der Stelle tretet.
Punstein: Ich glaube, ich spreche da für das ganze Team, wenn ich sage, dass unsere Betreuung genial war. Wir hatten drei verschiedene Professoren als Ansprechpartner, und die kamen aus der Mikrobiologie und der Biotechnologie. Außerdem haben uns neun Doktoranden aus der Biotech betreut und waren gerade in den ersten ein bis zwei Monaten wirklich ziemlich viel dabei, uns anzuleiten. Das haben sie alles parallel zu ihrer Doktorarbeit gemacht. Sobald wir das aber einmal drauf hatten, haben wir selbständig weiter gemacht. Also ich würde sagen, sicher das letzte halbe Jahr bis zum Wettbewerb war das der Fall. Es gab dann jede Woche ein Team-Meeting, bei dem auch die Professoren und Doktoranden dabei waren. Dann haben wir die Ergebnisse diskutiert und wie wir weiterarbeiten könnten. Die Experimente haben wir dann aber selber geplant und durchgeführt. Ich bin unglaublich dankbar und froh, dass ich bei iGEM dabei war. Denn genau dieses selbständige Arbeiten zu lernen, das war extrem wertvoll.
Werdet ihr auch jetzt nach iGEM noch weitermachen mit „Chlamy Yummy“?
Punstein: Drei meiner Teamkollegen machen jetzt grad ihre Bachelor-Arbeiten und arbeiten momentan daran, die Effizienz der PETase zu steigern und mehr davon zu sekretieren. Wir wollen in einigen Monaten auch ein Paper schreiben – also unsere gesamte iGEM-Gruppe in der Autorenliste. Und Michael Schroda möchte ebenfalls gern, dass das Projekt in seiner Gruppe weitergeführt wird. Also ich denke, dass da nichts liegenbleibt. Dafür wäre die ganze Arbeit auch zu schade gewesen.
Die Fragen stellte Mario Rembold
Foto: Pixabay/JayMantri