Die CARMEN-Mikrotiterplatte mit hunderten Miniaturvertiefungen
Kommen in einer Patientenprobe verschiedene Viren als Erreger in Frage, muss diese entsprechend viele verschiedene Tests durchlaufen. Bei den unzähligen Viren-Spezies, die Menschen infizieren können, ist dies eine ziemliche Mammutaufgabe.
Einfacher wäre es, wenn man viele verschiedene Viren parallel detektieren könnte. Ein Forscherteam um das Multitalent Pardis Sabeti (sie singt in ihrer Freizeit bei der Band Thousand Days) vom Broad Institute entwickelte deshalb die Test-Plattform CARMEN-Cas13 (Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic Acids), die 169 Viren-Spezies gleichzeitig detektieren kann – darunter auch SARS-CoV-2.
Für CARMEN-Cas13 wird die Viren-Zielsequenz mit spezifischen Primern amplifiziert und mit einer CRISPR-Cas13-basierten Strategie nachgewiesen. Hierzu wird Cas13 mit einer crRNA zur komplementären Zielsequenz geführt. Ist in der Probe eine komplementäre Sequenz enthalten, dockt die crRNA an diese an und aktiviert die Nuklease-Funktion der mitgeführten Cas13. Anders als Cas9 schneidet Cas13 aber nicht vor Ort, sondern schnippelt wahllos herum. Das macht sie zum perfekten Reporter-Enzym. Als Substrat schiebt man ihr eine RNA unter, die an einem Ende eine fluoreszierende Gruppe und am anderen einen Quencher trägt. Zerschneidet Cas13 die RNA, fluoresziert diese und zeigt hierdurch eine positive Probe an.
Viele Proben, ein Reporter
Wie aber kann man die vielen Proben mit nur einem Reporter-Molekül auf dutzende Viren gleichzeitig untersuchen? Der Trick besteht darin, sowohl die amplifizierten Proben als auch die crRNAs, mitsamt Cas13 sowie Fluoreszenz-Reporter (Detektionsmix), in winzigen, mit AlexaFluor-Farbstoffen codierten Tröpfchen unterzubringen. Farbstoff- und Nuleinsäuremoleküle sind hierbei nicht kovalent verbunden, sondern liegen nur im selben winzigen Tröpfchen vor.
Für die Farbcodierung füllt man einen 8er-PCR-Streifen mit den verschiedenen Proben und einen weiteren mit dem Detektionsmix der unterschiedlichen crRNAs. In jedes Tube gibt man anschließend eine individuelle Farblösung sowie eine fluorhaltige Ölverbindung als Tensid. Ein automatischer Tröpfchengenerator generiert danach aus den Ansätzen Emulsionen.
Da man anhand der Fluoreszenzfarbe von jedem Tröpfchen weiß, welche Probe beziehungsweise crRNA es enthält, kann man alle 64 Emulsionen in einem gemeinsamen Tube poolen. Anschließend spült man die Lösung über eine spezielle Mikrotiterplatte. Diese enthält hunderte Miniaturvertiefungen, in denen jeweils zwei Tröpfchen Platz finden.
Farbcode entlarvt Virus
Sind alle Tröpfchen in den Wells eingelocht, stellt man mit einem Fluoreszenz-Mikroskop ihre Identität fest. Mithilfe eines elektrischen Feldes werden die Tröpfchen danach vereint, wodurch die Cas13-Detektionsreaktion eingeleitet wird. Anhand des Farbcodes kann man schließlich herausfinden, welches Virus sich hinter einer positiven Reaktion verbirgt.
Sabetis Gruppe hatte ihr Manuskript schon vor dem Ausbruch von SARS-CoV-2 eingereicht. Während des Peer Reviews entwickelte sie aber auf die Schnelle noch ein Coronavirus-Test-Panel, das auch SARS-CoV-2 enthält. Mit diesem können mehr als 400 Proben parallel getestet werden.
Andrea Pitzschke
Foto: Michael James Butts (MIT)
Ackerman C. et al. (2020): Massively multiplexed nucleic acid detection using Cas13. Nature, DOI: 10.1038/s41586-020-2279-8