Vereinfachte Probenaufbereitungs-Verfahren für den Nachweis von SARS-CoV-2, die ohne aufwändige RNA-Extraktion auskommen, wirken sich meist negativ auf die Sensitivität des Tests aus. Besteht die Aufbereitung zum Beispiel nur aus einer kurzen Hitzebehandlung, sind bei der anschließenden qPCR fünf bis sieben Zyklen mehr nötig als bei RNA-Proben, die mit Silica-Säulen extrahiert wurden.
Mit dem Precipitation-Enhanced-Analyte-Retrieval-Verfahren (PEARL), das die Gruppe von Diego Acosta-Alvear an der University of California, Santa Barbara, entwickelte, passiert dies nicht, obwohl es genauso schnell und einfach durchzuführen ist. Zudem ist PEARL auch dazu geeignet, in einem Aufwasch Nukleinsäuren und Proteine von Wirt und Virus zu isolieren.
Simples Protokoll
Das Protokoll von PEARL ist denkbar einfach. Zu 250 Mikrolitern flüssigem Probenmaterial gibt man:
- 500 Mikroliter Extraktionspuffer mit 0,5 Prozent Oktylphenoxypolyethoxyethanol (IGEPAL, Detergenz zur Membranlyse)
- 450 mM Natriumacetat
- 20 Prozent Glycerol
- 20 mM TCEP (Reduktionsmittel)
- 50 µg/ml lineares Polyacrylamid als Co-Präzipitant für RNA und DNA
- 20 mM HEPES-KOH (pH 7,2).
Während der fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur lösen sich Zellmembranen und Virushüllen auf. Durch Zugabe von 750 Mikroliter eisgekühltem Isopropanol fällt man anschließend Nukleinsäuren und Proteine. Das Pellet wird zehn Minuten bei 19.000 g zentrifugiert, in einem Milliliter 75-prozentigem Ethanol gewaschen und fünf Minuten an der Luft getrocknet. Zum Abschluss resuspendiert man es in zwanzig Mikroliter Nuklease-freiem Wasser.
Kein Unterschied
Die Gruppe verglich Proben, die mit PEARL sowie einem kommerziellen Extraktions-Kit extrahiert wurden, in einer RT-qPCR, die auf das N-Gen von SARS-CoV-2 sowie das humane RNAse P-Gen abzielte. Einen signifikanten Unterschied stellte sie dabei nicht fest.
Dass man mit PEARL neben RNA auch DNA und Proteine fällen kann, macht die Technik auch für Analysen beliebiger Virusinfektionen interessant. Die kalifornischen Forscher infizierten iSLK-219-Zellen gezielt mit dem Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV), einem DNA-Virus. Außerdem infizierten sie HeLa-Zellen mit dem ZIKA-Virus (ZIKV, RNA-Virus). Anschließend extrahierten sie mit PEARL Nukleinsäuren und Proteine und bestimmten diese mit qPCR beziehungsweise Western Blot. Um nur DNA oder RNA zu testen, behandelte die Gruppe die PEARL-Extrakte jeweils mit DNAse oder RNAse, oder im Fall des Western Blots gleichzeitig mit DNAse und RNAse.
Bis zu 100.000 Zellen nötig
Die Detektionsschwelle für den Nachweis von ZIKV- und Wirtszell-Transkripten sowie genomischen KSHV-Sequenzen lag hierbei bei circa 1.000 Zellen. Da die Forscher das KSH-Virus zudem mit einem konstitutiv exprimierten GFP-Gen ausgestattet hatten, konnten sie die iSLK-219-Extrakte parallel per Western Blot testen. Bei anti-GFP-Antikörpern und Meerrettich-Peroxidase-gekoppeltem Sekundär-Antikörper lag die Nachweisgrenze bei etwa 10.000 Zellen. Für die Immundetektion eines endogenen Virusproteins (LANA) waren etwa 100.000 Zellen nötig. Dot Blots waren in beiden Fällen etwa zehnmal sensitiver.
Andrea Pitzschke
Ponce-Rojas J. et al. (2020): A fast and accessible method for the isolation of RNA, DNA, and protein to facilitate the detection of SARS-CoV-2. BioRxiv, DOI: 10.1101/2020.06.29.178384
Bild: flickr/Pablo Ramdohr