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Günstige Alternative

(15.07.2020) Schnell, billig und einfach ist ein neues Extraktions­verfahren, mit dem man Nukleinsäuren und Proteine aus Virus und Wirt gleichzeitig isolieren kann.
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Vereinfachte Proben­aufberei­tungs-Verfahren für den Nachweis von SARS-CoV-2, die ohne aufwändige RNA-Extraktion auskommen, wirken sich meist negativ auf die Sensitivität des Tests aus. Besteht die Aufbereitung zum Beispiel nur aus einer kurzen Hitze­behandlung, sind bei der anschließenden qPCR fünf bis sieben Zyklen mehr nötig als bei RNA-Proben, die mit Silica-Säulen extrahiert wurden.

Mit dem Precipitation-Enhanced-Analyte-Retrieval-Verfahren (PEARL), das die Gruppe von Diego Acosta-Alvear an der University of California, Santa Barbara, entwickelte, passiert dies nicht, obwohl es genauso schnell und einfach durch­zuführen ist. Zudem ist PEARL auch dazu geeignet, in einem Aufwasch Nukleinsäuren und Proteine von Wirt und Virus zu isolieren.

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Simples Protokoll

Das Protokoll von PEARL ist denkbar einfach. Zu 250 Mikrolitern flüssigem Proben­material gibt man:

- 500 Mikroliter Extraktions­puffer mit 0,5 Prozent Oktyl­phenoxy­polyethoxy­ethanol (IGEPAL, Detergenz zur Membranlyse)
- 450 mM Natrium­acetat
- 20 Prozent Glycerol
- 20 mM TCEP (Reduktions­mittel)
- 50 µg/ml lineares Poly­acryl­amid als Co-Präzipitant für RNA und DNA
- 20 mM HEPES-KOH (pH 7,2).

Während der fünf­minütigen Inkubation bei Raum­temperatur lösen sich Zell­membranen und Virus­hüllen auf. Durch Zugabe von 750 Mikroliter eisge­kühltem Isopropanol fällt man anschließend Nuklein­säuren und Proteine. Das Pellet wird zehn Minuten bei 19.000 g zentrifugiert, in einem Milliliter 75-prozentigem Ethanol gewaschen und fünf Minuten an der Luft getrocknet. Zum Abschluss resuspendiert man es in zwanzig Mikroliter Nuklease-freiem Wasser.

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Kein Unterschied

Die Gruppe verglich Proben, die mit PEARL sowie einem kommerziellen Extraktions-Kit extrahiert wurden, in einer RT-qPCR, die auf das N-Gen von SARS-CoV-2 sowie das humane RNAse P-Gen abzielte. Einen signifi­kanten Unterschied stellte sie dabei nicht fest.

Dass man mit PEARL neben RNA auch DNA und Proteine fällen kann, macht die Technik auch für Analysen beliebiger Virus­infektionen interessant. Die kalifor­nischen Forscher infizierten iSLK-219-Zellen gezielt mit dem Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV), einem DNA-Virus. Außerdem infizierten sie HeLa-Zellen mit dem ZIKA-Virus (ZIKV, RNA-Virus). Anschließend extrahierten sie mit PEARL Nuklein­säuren und Proteine und bestimmten diese mit qPCR beziehungs­weise Western Blot. Um nur DNA oder RNA zu testen, behandelte die Gruppe die PEARL-Extrakte jeweils mit DNAse oder RNAse, oder im Fall des Western Blots gleichzeitig mit DNAse und RNAse.

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Bis zu 100.000 Zellen nötig

Die Detektions­schwelle für den Nachweis von ZIKV- und Wirtszell-Transkripten sowie genomischen KSHV-Sequenzen lag hierbei bei circa 1.000 Zellen. Da die Forscher das KSH-Virus zudem mit einem konstitutiv exprimierten GFP-Gen ausgestattet hatten, konnten sie die iSLK-219-Extrakte parallel per Western Blot testen. Bei anti-GFP-Antikörpern und Meerrettich-Peroxidase-gekoppeltem Sekundär-Antikörper lag die Nachweis­grenze bei etwa 10.000 Zellen. Für die Immun­detektion eines endogenen Virusproteins (LANA) waren etwa 100.000 Zellen nötig. Dot Blots waren in beiden Fällen etwa zehnmal sensitiver.

Andrea Pitzschke

Ponce-Rojas J. et al. (2020): A fast and accessible method for the isolation of RNA, DNA, and protein to facilitate the detection of SARS-CoV-2. BioRxiv, DOI: 10.1101/2020.06.29.178384

Bild: flickr/Pablo Ramdohr


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Letzte Änderungen: 15.07.2020

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