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Tot oder lebendig?

(04.11.2020) Vitalitätsfärbungen kosten wertvolle Zeit und etlichen Zellen das Leben. Schneller und schonender ist der Vitalitäts­test mit einem speziellen Mikroskop.
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Wer in Zellkulturen die Lebenden von den Toten oder Geschä­digten unterscheiden will, nutzt dazu meist Farbstoffe wie Trypanblau, die nur durch beschädigte Zell­membranen wandern können, nicht aber durch die intakte Barriere gesunder Zellen. Dieses Vorgehen kostet aber nicht nur Zeit, sondern fordert auch Opfer: Der Farbstoff benötigt meist eine gute Viertel­stunde, bis er sein Ziel erreicht hat und richtet in dieser Zeit auch in gesunden Zellen Schäden an, was Langzeit-Beobach­tungen vereitelt. Welche Zellen von Anfang an tot waren, und welche ihr Leben erst durch den Farbstoff verloren haben, ist deshalb nicht immer exakt zu erkennen.

Gabriel Popescus Gruppe von der Universität Illinois suchte eine Alternative zu Farbstoff-basierten Vitali­tätstest und entwickelte ein Mikroskopie-Verfahren, das auf Farbstoffe oder sonstige Reagen­zien verzichtet. Dazu stattete sie ein Phasen­kontrast-Mikroskop mit einem sogenannten Spatial-Light-Inter­ference-Microscopy-Modul, kurz SLIM-Modul aus, das Popescu schon vor knapp zehn Jahren ausgetüftelt hat (Opt Express, 19(2): 1016–26).

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Inzwischen kann man SLIM-Module bei entsprechenden Händlern kaufen und einfach an das Mikroskop anschließen. Die Bildsignale des Phasen­kontrast-Mikroskops werden zum SLIM-Modul weiter­geleitet und dort mit Breitband-LED-Licht bestrahlt. Je nach Proben­struktur führt dies zu Phasen­verschiebungen der Lichtwellen, die als Quanti­tative Phase Imaging (QPI)-Maps aufgezeichnet werden.

Mithilfe der QPI-Maps lassen sich prinzipiell tote und lebende Zellen aufgrund ihrer verschie­denen Merkmale unterscheiden. Dazu mussten Popescus Mitarbeiter jedoch zunächst einem Computer­hirn beibringen, die entspre­chenden Charak­teristika toter und lebender Zellen in den QPI-Maps zu erkennen. Hierzu färbten sie HeLa-Zellen mit dem Zellvia­bilitäts-Farbstoff NucBlue, der Membranen durch­dringt und sämtliche Zellkerne blau färbt, sowie dem Farbstoff NucGreen, der nur lecke Membranen passieren kann und den Zellkern grün fluores­zieren lässt.

Anschließend beobachteten sie hunderte HeLa-Zellen über zehn Stunden mit dem SLIM-Modul sowie einem Epifluo­reszenz-Mikroskop. Für jeden Zellkern und Zeitpunkt ermittelte die Gruppe das Signal­verhältnis von NucGreen zu NucBlue für lebende, geschädigte oder tote Zellen. Mit den Daten trainierten die Forscher schließlich ein neuronales Netzwerk in der Auswertung der QPI-Maps.

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Vergleichbar mit Farbstofftest

Die Treffsicherheit dieses sogenannten Phase Imaging with Computational Specificity (PICS)-Systems kann sich durchaus sehen lassen. Bei einem Test mit HeLa-Zellen erkannte es 73 Prozent der lebenden Zellen, 97 Prozent der geschä­digten und 94 Prozent der toten. Ein als Vergleich eingesetzter Farbstoff-basierter Vitali­tätstest lieferte ähnliche Zahlen. Angesichts der vergleichs­weise schwachen Treffer­quote von PICS bei lebenden Zellen schlagen die Forscher vor, einfach alle Zellen als vital einzu­stufen, die nicht als geschädigt oder tot erkannt werden.

Mit ein paar zusätzlichen Trainings­einheiten für das neuronale Netzwerk könnte sich das PICS-System zu einem ernst­haften Konkurrenten für Vitalitäts­färbungen entwickeln.

Andrea Pitzschke

Hu C. et al. (2020): Label-free cell viability assay using phase imaging with computational specificity. BioRxiv, DOI: 10.1101/2020.10.28.359554

Bild: Pixabay/CreativeMagic


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Letzte Änderungen: 04.11.2020

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