(30. November 2012) In der letzten Ausgabe 11/2012 von Laborjournal berichteten wir, wie man mit lichtempfindlichen Kationkanälen (Opsinen) aus Mikrooganismen neuronale Aktivität steuern kann. Diese genetischen Werkzeuge lassen sich derart genau in bestimmten Zellen oder Zellpopulationen platzieren, dass man diese gezielt aktivieren oder inhibieren kann.
Eine weitere Gruppe optogenetischer Werkzeuge erlaubt dagegen vielmehr, molekulare Prozesse in den Neuronen selbst zu beobachten. Dazu gehören genetisch kodierte, fluoreszierende Kalzium- und Spannungssensoren. Diese Moleküle transformieren elektrische Signale in Lichtsignale. Die Spannungssensoren reagieren direkt auf Änderungen des neuronalen Membranpotenzials; Kalziumsensoren zeigen dagegen Änderungen der interzellulären Kalziumkonzentration an, die in vielen Zelltypen mit einem Aktionspotenzial einhergehen.
Aktionspotenziale sehen
Wie kann man diese Sensoren nutzen, was kann man Neues entdecken? Dies fragten wir Thomas Knöpfel vom RIKEN Brain Science Institute in Japan. Der gebürtige Deutsche, der in Ulm Physik und Medizin studierte, beschäftigt sich seit Jahren mit der Entwicklung und Anwendung von spannungsabhängigen Sensoren. Er schrieb uns aus Kuala Lumpur per E-Mail:
„Die VSFP [für voltage sensitive fluorescent protein, die Red.]-Moleküle wandeln die elektrischen Signale in Lichtsignale um, so dass wir mit einer empfindlichen Kamera die Informationsverarbeitungsprozesse quasi filmen können. Solche optischen Messungen liefern ein umfassendes Bild der Aktivität vieler Tausender von Nervenzellen – und nicht nur von einzelnen oder relative wenigen Messpunkten, wie das mit herkömmlichen Mikroelektrodenmessungen möglich ist. Da diese optischen Reporter neuronaler Aktivität mit genetischen Methoden sehr genau in bestimmte Zellpopulationen platziert werden können, können wir nun auch ganz gezielt Wahrnehmungs-, Entscheidungs- und andere Denkprozesse im Tierversuch studieren. Neben der reinen Grundlagenforschung sehe ich auch Anwendungsmöglichkeiten bei der Aufklärung krankhafter Denkprozesse.“
Im Prinzip gilt dies auch für Kalziumsensoren.
Prototypen der spannungsabhängigen Sensoren waren FlaSh, SPARC und VSFP1. Für FlaSh hatten Forscher aus Berkeley und Pasadena ein GFP an den Shaker-Kaliumkanal von Drosophilaangehängt, bei SPARC dagegen hatten Yale-Wissenschaftler ein GFP mit einem Natriumkanal von Skelettmuskeln kombiniert. VSFP1, welches die Knöpfel-Gruppe 2001 einführte, besteht aus einer spannungsempfindlichen Domäne des Kv2.1-Kaliumkanals sowie zwei Fluoreszenzproteinen, die ein FRET-Signal aussenden, wenn sich das Membranpotenzial ändert (FRET = Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer).
Alle diese Proteine verhalten sich allerdings ziemlich störrisch: sie lassen sich nicht in ausreichenden Mengen in den Plasmamembranen positionieren. Deutlich besser funktioniert eine Phosphatase aus der Seescheide Ciona intestinales, die zwar kein Ionenkanal ist, aber spannungsabhängig reagiert. Daraus bastelte Dimitar Dimitrov aus der Knöpfel-Gruppe schließlich den membranständigen VSFP2.1-Sensor (PLoS ONE 2(5): e440. doi:10.1371/journal.pone.0000440). Dieses Molekül fluoresziert cyanfarben und ändert die Farbe in gelb, wenn ein depolarisierender Spannungspuls die Membran erreicht. Davon ausgehend entwickelten die Forscher nachfolgend eine Reihe anderer VSFPs mit weiter im Roten liegenden Emissionen. Mit VSFP2.3 haben Knöpfel und Co. schließlich erstmals Aktionspotenziale und synaptische Potenziale an Gehirnschnitten und lebendigen Mäusen optisch darstellen können (Nature Methods 2010, Vol. 7, S. 643).
Die dritte Generation VSFPs enthält jeweils nur ein Fluoreszenzprotein. Es gibt mehrere Varianten mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsfarben. Diese Moleküle erwiesen sich als schnell genug, neuronale Signale bildlich darzustellen, sie haben aber kleinere Amplituden als FRET-Vertreter der VSFP2-Familie.
Kalziumströme verfolgen
Neuronale Aktionspotenziale rufen nicht nur elektrische Änderungen an den Membranen, sondern auch deutliche Veränderungen der Kalziumströme hervor. Daher werden bildgebende Nachweise von Kalzium gerne benutzt, um die Aktivität individueller Neuronen zu beobachten. Dies gelingt beispielsweise mit so genannten „genetic encoded Calcium indicators” – GECIs. Sie bestehen im Prinzip aus Fluoreszenzprotein(en) (FPs) und einem Kalzium-bindenden Molekül, meist Calmodulin oder Troponin C.
Die ersten Indikatoren wie „Cameleon“ aus dem Labor des GFP-Gurus Roger Tsien bestanden aus zwei Fluoreszenzproteinen und einer Kalzium-bindenden Domäne. Hier wird die Fluoreszenz zum Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ausgelöst, wenn sich die beiden Domänen in einer durch Kalzium induzierten Konformationsänderung einander annähern.
Ein anderer Typus GECIs enthält nur ein Fluoreszenzprotein, dessen N- und C-Termini miteinander fusioniert und parallel neue Termini in der Molekül-Mitte kreiert wurden. An diese Enden hängte man ein Calmodulin bzw. ein M13-Peptid – und das Ganze nannten die Erfinder des Konstrukts schließlich GCaMP, der Reihenfolge der Genbausteine entsprechend (Nature Biotechnology 2001, Vol. 19., S. 137). Auch diese Sensoren fluoreszieren erst, wenn Kalzium eine Änderung der Struktur des Moleküls ausgelöst hat.
Mit solchen und ähnlichen Konstrukten konnten einzelne Aktionspotenziale an Neuronen verschiedener Tiere beobachtet werden. Die ersten Varianten der Sensoren waren nicht perfekt, vor allem das Signal-Rausch-Verhältnis hätte besser sein können. Manche Sensoren erwiesen sich überdies bei langer Überexpression als cytotoxisch. Und schließlich hätte man auch gerne fluoreszierende Proteine benutzt, die nicht mit einem anderen Farbspektrum als GFP arbeiten. Denn GFP reagiert auf die gleiche Wellenlänge wie andere Licht-gesteuerte Kationenkanäle, etwa Kanalrhodopsin 2 (ChR2), die man im gleichen Experiment untersuchen möchte.
Weil diese Reportergene aber so extrem nützlich erschienen, so sie denn perfekt funktionieren würden, hat man in den letzten zehn Jahren viel geforscht, um ihnen diese Kinderkrankheiten auszutreiben. So existieren inzwischen beispielsweise verschiedene neue GCaMPs, die durch Proteinevolution hergestellt wurden. Yongxin Zhao und Kollegen aus der Arbeitsgruppe von Robert Campbell, University of Alberta, Kanada, fanden in einem Hochdurchsatz-Screening mehrere Sensoren, die nicht nur deutlich stärker als die bisher bekannten Moleküle fluoreszieren, sondern sich auch mit anderen Wellenlängen als GFP anregen lassen (Science 2011, Vol. 333, S. 1888). Sie nannten diese Proteine B-GECO, R-GECO und G-GECO (für Blau, Rot, Grün). Damit lassen sich nun prinzipiell die Kalziumströme in verschiedenen Organellen gleichzeitig visualisieren.
Einen weiteren rot fluoreszierenden, mit 568 nm Licht anregbaren GECI entwickelte die Gruppe von Junichi Nakai vom RIKEN Brain Science Institute. Die Forscher testeten diesen Sensor insbesondere an Neuronen von Ratten, indem sie die Zellen gleichzeitig mit Genen für den Sensor sowie für einen ChR2-Kanal transfizierten. Mit 488 nm Licht öffneten sie die ChR2-Kanäle, was Aktionspotenziale auslöste, die sie unmittelbar mit Patch Clamp nachwiesen. Transiente Kalziumströme konnten sie über die Fluoreszenz des Sensors bei 617 nm beobachten. 2012 schrieben die Japaner dazu in PLoS ONE (Vol. 7, e39933): „...we demonstrated that our improved red fluorescent GECI, that was excited at a wavelength substantially distinct from the action spectra of ChR2, enabled the imaging of neuronal activity triggered by ChR2.“
Noch werden diese neuen Moleküle immer weiter verbessert. Beispielsweise müssen sie idealerweise so schnell sein wie die neuronalen Signale selbst – also innerhalb weniger Millisekunden reagieren. Mit Spannungssensoren gelingt dies bereits. Ein Kalziumsensor dagegen kann natürlich erst deutlich nach der Änderung des Membranpotenzials anspringen, da die Ionen erst danach einströmen.
Ein zweites Problem ist das Signal-Rausch-Verhältnis. Die zur Zeit verfügbaren Kalziumsensoren geben ein intensiveres Fluoreszenzsignal ab als die Spannungsssensoren, weshalb sie auch häufiger eingesetzt werden. Allerdings gibt Knöpfel als Spannungssensor-Experte zu bedenken: „Das SRV hängt aber nicht nur von der Sensitivität des Spannungsensors ab, sondern auch von der Intensität, mit der die fluoreszierenden Proteine angeregt werden. Da alle bekannten fluoreszierenden Proteine nicht allzu lichtstabil sind und daher bei hoher Anregungsintensität ausbleichen, sollte das SRV auf die Ausbleichrate normalisiert angegeben werden.“
Wie Verhalten in Neuronen abgebildet wird
Die Zukunft wird zeigen, wie gut diese neuen Sensoren in vivo funktionieren. Bevor man sich selber in solche Experimente stürzt, empfiehlt Knöpfel jedoch, die Eigenschaften der verschiedenen Sensoren genau zu studieren, um je nach Fragestellung und zu untersuchendem Gewebe die besten Moleküle zu verwenden.
Welches Potenzial in dieser Art Experiment steckt, zeigten erst kürzlich Forscher vom Janelia Farm Research Campus (USA) sowie vom Zentrum für molekulare Neurobiologie in Hamburg. Über mehrere Wochen dokumentierten sie mit Kalziumsensoren, was in einer bestimmten Neuronenpopulation passiert, wenn Mäuse lernen, in bestimmter Art und Weise auf Berührung ihrer Tasthaare zu reagieren. Es zeigte sich, dass die Repräsentationen der individuellen L2/3-Pyramidalneuronen sich mit diesem Lernen ändern: Während die Mäuse sensomotorische Aufgaben lösten, stabilisierte sich zwar die Repräsentation dieses Verhaltens in der Neuronenpopulation insgesamt, die individuellen Neuronen konnten jedoch sehr variabel auf die Reize reagieren (Nature Methods 2012, Vol. 484, S. 473).
Karin Hollricher