„Wir konnten zeigen, dass der neue Wirkstoff in den Umbau des Aktinzytoskeletts bei der Zellwanderung eingreift“, erläutert Gruppenleiter Ronald Kühne vom Berliner Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie. In den neu entwickelten Peptid-Liganden wurden Prolinreste durch synthetisierte organische Moleküle ersetzt. Die Moleküle unterbinden dadurch Protein-Protein-Interaktionen, die durch prolinreiche Motive vermittelt werden.
Fruchtbare Zusammenarbeit
Eines dieser Moleküle, Compound 4b, unterdrückt in einer Brustkrebszelllinie die Rekrutierung von VASP (Vasodilatator-Stimuliertes Phosphoprotein) zu den Proteinen Zyxin und Lamellipodin. „Im Matrigel-Invasions-Assay waren solche Zellen dann nicht mehr in der Lage, sich durch eine zelluläre Barriere hindurchzufressen“, so Kühne.
Zyxin findet sich in fokalen Adhäsionspunkten, über die sich die Zellmembran an das umgebende Substrat anheftet. Die Adhäsionspunkte werden von festsitzenden Zellen sowie während der Zellwanderung ausgebildet. Lamellipodin dagegen bringt Ena/VASP-Proteine an die Spitze von Lamellipodien, also zu Ausstülpungen, die ebenfalls für die Wanderung von Zellen wichtig sind.
In Darmkrebszellen unterdrückte Compound 4b die Ausbildung von Stressfasern – das sind Aktinfilamente, die fokale Adhäsionspunkte miteinander verbinden. Stressfasern sind in dieser Zelllinie besonders gut sichtbar.
Der neue Wirkstoff behindert also das Andocken der Ena/VASP-Proteine an die fokalen Adhäsionspunkte und an die Wanderungsfront der Zellmembran und beeinträchtigt so die Wanderungsfähigkeit der Tumorzellen. Die Ergebnisse erschienen im April 2015 in der Fachzeitschrift PNAS (Vol. 112: 5011-6).
Neben Wissenschaftlern des Leibniz-Instituts für Molekulare Pharmakologie waren an der Studie Forscher der Universität Köln, des Berliner Max Delbrück Centrums für Molekulare Medizin sowie des Instituts für Chemie und Biochemie der Freien Universität Berlin beteiligt. Die vier Erstautoren Robert Opitz, Matthias Müller, Cedric Reuter und Matthias Barone waren jeweils für biophysikalische Analysen, zellbiologische Versuche, die Syntheseoptimierung sowie für kristallographische Untersuchungen zuständig.
Knifflige Synthese
„Begonnen haben wir mit diesem Projekt vor sieben Jahren“, berichtet Gruppenleiter Kühne. Die damals verfügbaren Peptid-Liganden gegen prolinreiche Motive waren in Zellen instabil, hatten keine überlegene Affinität und ließen sich nur relativ umständlich in Zellen einbringen. „Wir haben zuerst die Erkennungsprinzipien prolinreicher Motive durch die entsprechenden Erkennungsdomänen herausgearbeitet“, erzählt der Spezialist für computergestützte Chemie und Drug Design. „Diese Motive bilden in wässriger Lösung eine linksgängige Polyprolin II-Helix. Sie enthalten entweder PXXP- oder XPPX-Konsensusmotive, wobei P für Prolin steht und X für jede beliebige Aminosäure. EVH1-Domänen, zum Beispiel, erkennen das Motiv PXXP“, führt er aus.
Als Ausgangspunkt für die Herstellung neuer Peptid-Liganden diente ein gut charakterisiertes Peptid aus dem ActA-Protein des pathogenen Bakteriums Lysteria monocytogenes. Die eingebauten Prolinersatzverbindungen sollten die Ausbildung einer Polyprolin II-Helix unterstützen. Ihre Synthese übernahm die Gruppe von Seniorautor Hans-Günther Schmalz von der Universität Köln, einem Spezialisten für die Herstellung komplexer organischer Verbindungen.
„Das war ein äußerst steiniger Weg“, bemerkt Schmalz. „Für die Synthese hatten wir optimistisch zunächst ein halbes Jahr angesetzt.“ Am Ende waren dafür mehrere Arbeitsjahre eines Doktoranden nötig. Die Herausforderung lag darin, die dreidimensionale Struktur präzise festzulegen, das heißt, möglichst reine Stereoisomere und keine Gemische davon zu produzieren.
Die Synthese des ersten Prolinersatzbausteins umfasste anfangs noch 24 Schritte. Sie konnte aber nach und nach verkürzt und optimiert werden. So steht den Forschern mittlerweile eine ganze Serie solcher Bausteine zur Verfügung, die sich modular verknüpfen lassen. Die Strukturexperten konnten diese Prolinersatzbausteine erfolgreich in unterschiedlichen Kombinationen in Peptidliganden einbauen und damit auch andere Erkennungssequenzen prolinreicher Motive spezifisch blockieren.
Zahlreiche potentielle Anwendungen
Prolinreiche Aminosäuremotive finden sich häufig in Peptiden, die an intrazellulären Signalübertragungsvorgängen beteiligt sind. Die Oberfläche der dazugehörigen Erkennungsdomänen ist flach und unauffällig. Dennoch binden sie an prolinreiche Motive hochspezifisch und mit moderater Affinität im mikromolaren Bereich. Auf diese Weise ermöglichen sie in der Zelle die vorübergehende Zusammenlagerung von Multiproteinkomplexen für die Signaltransduktion. „Die konservierten Prolin-Reste bilden dabei besonders starke Wasserstoffbrücken mit den Seitenketten von exponierten aromatischen Resten der Erkennungsdomänen aus. Flankierende Aminosäurereste um die prolinreichen Motive beeinflussen, wie stark und spezifisch die Bindung ist“, erklärt Kühne.
Ihre Prolinersatzbausteine haben sich die Forscher patentieren lassen. Da prolinreiche Bindemotive eines der häufigsten Motive im Proteom sind, ist die Liste potentieller Anwendungsmöglichkeiten lang.
Testen wollen die Forscher ihre neuen Liganden zunächst bei Tumoren sowie bei bakteriellen und neurodegenerativen Erkrankungen. Derzeit läuft in Köln die Wirkstoffsynthese auf Hochtouren, um die Wirkung von Compound 4b auf die Tumormetastasierung im Tiermodell analysieren zu können. Darüber hinaus werden wichtige Parameter bestimmt, wie die Stabilität der Verbindung in Lebermikrosomen und im Plasma. Kühne selbst sieht sich allerdings in erster Linie als Grundlagenforscher, der wissenschaftliches Neuland erschließt und erst in zweiter Linie als Medikamentenentwickler.
„Mit unseren spezifisch wirkenden chemischen Substanzen wollen wir zelluläre Prozesse zunächst einmal besser verstehen“, so der Wissenschaftler.
Bettina Dupont
Bild: Überlagerung der Kristallstrukturen einer EVH1-Domäne im Komplex mit dem Peptidmotiv FPPPP (weiß) und Compound 4a (farbig), Copyright: R. Kühne