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DNA-Interferenz (DNAi)

von Mario Rembold (Laborjournal-Ausgabe 10, 2015)


Stichwort

Offenbar drosseln bisweilen auch kurze DNA-Frag­mente die Expression bestimmter Gene. Illustr.: Univ. Bergen

Doppelsträngige RNA, die zielgerichtet Proteinsynthese herunterreguliert – dieses Phänomen kennt man unter dem Namen RNA-Interferenz oder RNAi. Dabei erkennt die Zelle die Doppelstrang-RNA, schneidet sie in mehrere Stücke und packt diese in Proteinkomplexe. Dort dienen sie als Schablone, um mRNA-Stränge mit komplementären Abschnitten zu finden und abzubauen.

Mittlerweile schätzen Molekularbiologen die RNAi als Knockdown-Werkzeug, um die Translation zu bremsen. Der Mechanismus wurde an Petunien entdeckt, funktioniert in gängigen Modellen wie Fliege, Maus und Wurm – und man findet ihn quer durch die Bank bei allen möglichen Eukaryoten. Erfunden hat die Natur diesen Silencing-Mechanismus natürlich nicht für experimentierfreudige Forscher, sondern vielmehr zur Virenabwehr, aber auch für Steuerfunktionen in der Zelle.

Knockdown via PCR

Weit weniger verstanden ist das Desoxy-Pendant, die DNA-Interferenz. Bislang kannte man sie nur von einzelnen Vertretern der Pflanzen, Ciliaten und Archaeen – nicht aber bei Metazoen. Bis vor kurzem Forscher um Hiroki Nishida von der Universität Osaka verkündeten, DNAi erstmals auch im Tierreich nachgewiesen zu haben – und zwar beim Tunicaten Oikopleura dioica (Proc. Biol. Sci. 282(1807): 20150435).

Konkret amplifizierten die Japaner Abschnitte des Brachyury-Gens und injizierten die Doppelstrang-DNA in Oikopleura-Embryonen. Die Tiere entwickelten daraufhin fehlgebildete Schwänze – ein Phänotyp, der sich auch mit RNAi gegen die Brachyury-Sequenz induzieren lässt. Die Autoren betonen, dass der Mechanismus nicht identisch sei mit der sogenannten Co-Suppression, die man beispielsweise aus C. elegans kennt. Dabei fährt der Wurm die Expression eines Gens herunter, wenn zusätzliche Kopien ins Genom der Zellkerne eingebracht sind. Hierzu müssen die Transgene aber die Promotorregion enthalten.

Um Co-Supression in ihren Experimenten auszuschließen, hatten die Forscher keine Promotorregionen amplifiziert, sondern nur Abschnitte aus proteinkodierenden Exons oder Introns. Auch PCR-Produkte, die nur Intron-DNA enthielten, verursachten in den Embryonen typische Brachyury-Knockdown-Phänotypen. Da diese nicht-kodierenden Sequenzen in der reifen mRNA herausgeschnitten sind, vermuten die Autoren, dass der DNAi-Mechanismus auch die Transkription beeinträchtigt – ein grundlegender Unterschied zur RNAi, die ausschließlich mRNA erkennt und abbaut.

Zudem zeigte Nishidas Team aber, dass DNAi auch die Translation bereits vorhandener mRNA inhibiert. Hierzu verwendeten die Forscher die mRNA fluoreszierender Proteine. Falls DNAi bloß die Transkription stört, sollten auch diejenigen Embryonen, die komplementäre DNA injiziert bekommen, dieselbe Fluoreszenz zeigen wie die Kontrollen. Doch offenbar induziert die Doppelstrang-DNA – analog zur RNAi – auch den Abbau von mRNA, denn die Fluoreszenz fiel geringer aus. Dieser Effekt war sequenzspezifisch. So regulierte das PCR-Produkt zum Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) nur das EGFP-tragende Protein herunter und hatte keinen Einfluss auf mCherry-mRNA – und umgekehrt konnte ausschließlich mCherry-­homologe DNA die rote mCherry-Fluoreszenz verringern.

Konservierte Interferenz?

Auch die Länge der DNA-Fragmente hatte einen Einfluss auf die Stärke des Effekts. Der Brachyury-Phänotyp war bei den meisten heranwachsenden Larven deutlich ausgeprägt, wenn 100 Basenpaar-lange Exon-Fragmente zum Einsatz kamen. 50-Basenpaar-Exons hatten einen moderaten Effekt, bei 20 Basenpaaren waren keine Entwicklungsstörungen mehr zu beobachten.

Unklar bleibt, ob Oikopleura ein Einzelfall im Tierreich ist, oder ob DNAi ähnlich weit verbreitet ist wie die RNAi. In letzterem Fall wäre es aber erstaunlich, dass das Phänomen bislang noch nicht in anderen Studien aufgefallen ist – schließlich ist es Standard, fremde Doppelstrang-DNA in Drosophila und Co. einzuschleusen.

Bisher einfach übersehen?

„Ich glaube, es ist in der biologischen Forschung wenig verbreitet, kurze lineare DNA-Fragmente in Zellen einzubringen, verglichen mit dem Einführen zirkulärer Plasmid-DNA“, meint Erstautor Tatsuya Omotezako. In ihren Versuchen hatte das Team nämlich auch ringförmige DNA verabreicht, doch die zeigte, anders als bei DNAi-fähigen Pflanzen, keinen Knock­down-Effekt in Oikopleura. Das Phänomen könnte also im Tierreich bislang einfach übersehen worden sein. Andererseits hatten die Forscher aus Osaka auch einen Verwandten von Oikopleura untersucht, nämlich Halocynthia rorezi. Dort konnten sie keine DNAi nachweisen. „Allerdings funktioniert auch keine RNAi in Halocynthia“, merkt Omotezako dazu an.

Interessant zu wissen wäre auch, ob DNA- und RNA-Interferenz auf die gleichen molekularbiologischen Mechanismen zurückgreifen und denselben evolutionären Ursprung haben. 2013 hatten Daan Swarts et al. gezeigt, dass an der DNA-Interferenz im Archaeen Thermus thermophilus ein Argonautprotein beteiligt ist (Nature 507(7491): 258-6). Argonautenproteine kannte man bereits von der RNAi; sie binden Doppelstrang-RNA-Fragmente und bilden mit ihnen einen Komplex, der die Ziel-RNA erkennt und schneidet. Dass man zumindest in einem Organismus auch eine Verbindung zwischen DNAi und Argonautenproteinen herstellen kann, lässt gemeinsame Prinzipien vermuten. „Den Mechanismus dahinter hat man aber bislang nicht zeigen können“, stellt Omote­zako für die DNA-Interferenz klar.



Letzte Änderungen: 30.09.2015


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