(15.07.2019) Die Optogenetik wurde 2010 von Nature Methods als „Methode des Jahres“ auserkoren. Bis sie ihren Siegeszug antreten konnte, war aber jede Menge zäher Laborarbeit nötig. Und wer viel arbeitet, macht hin und wieder auch Klonierungsfehler.
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Ist Optogenetik die Genetik von Licht oder von Licht-Rezeptoren? Natürlich nicht, es handelt sich vielmehr um eine Methode zur Manipulation genetisch veränderter, transgener Zellen oder Lebewesen durch Licht. Der Begriff Optogenetics wurde 2006 von dem Bioingenieur und Psychiater Karl Deisseroth „erfunden“, dem ich 2004 die DNA für ein neuartiges Algenprotein an sein Labor in Stanford geschickt habe. Es war die DNA für Channelrhodopsin-2 (ChR2) – ein Licht-gesteuerter Kationenkanal aus der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii.
Dass ein Kationenkanal – also ein Membranprotein, das Kationen wie Natrium, Kalium oder sogar Calcium durch die Zellmembran passieren lässt – durch Licht geöffnet werden kann, war eine aufregende Entdeckung. Bekannt waren damals Ionenkanäle, die zum Beispiel durch eine Veränderung des Membranpotenzials oder durch Bindung von Neurotransmittern geöffnet werden.
Nachdem wir nachweisen konnten, dass dieses Algenprotein nicht nur in der Alge „funktionierte“, sondern auch in tierischen oder sogar menschlichen Zellen, wurde es umso interessanter für Anwendungen. Die Licht-gesteuerte Öffnung von ChR2 in Oozyten von Xenopus laevis oder kultivierten menschlichen HEK- Zellen hatten wir ein halbes Jahr zuvor gezeigt [1]. Uns war damals durchaus klar, dass die einzigartige Eigenschaft von Channelrhodopsin-2 viele neue Möglichkeiten bot, lebende Zellen oder Organismen durch Belichtung nicht-invasiv zu beeinflussen.
Bereits ein Jahr zuvor hatten wir in Science ein Protein von Chlamydomonas reinhardtii beschrieben, das bei Belichtung die Permeabilität für H+-Ionen (Protonen) erhöhte – sich also wie ein Protonenkanal verhielt [2]. Wir nannten es Channelrhodopsin-1 (ChR1) und schrieben im letzten Satz unseres Papers: „Moreover, the ability of ChR1 to mediate a large light-switched H+ conductance in oocytes holds promise for the use of ChR1 as a tool for measuring and/or manipulating electrical and proton gradients across cell membranes, simply by illumination.“
Wir erhielten allerdings nur wenige Anfragen nach der kodierenden DNA dieses neuartigen Proteins – vermutlich, weil die Licht-induzierten Ströme doch relativ klein und ein Protonenkanal nicht so interessant war. Jahre später stellte sich heraus, dass ChR1 auch permeabel ist für Kationen wie Natrium und Kalium – zumindest bei hohem pH-Wert. Zudem waren die kleinen Ströme darauf zurückzuführen, dass das Protein in der Zelle sehr instabil ist, weil es schnell wieder abgebaut wird.
Das Interesse an einem Licht-gesteuerten Ionenkanal wuchs jedoch sprunghaft mit unserer Entdeckung von ChR2, das deutlich größere Blaulicht-induzierte Ströme und eine eindeutige Permeabilität für Kationen wie Natrium-, Kalium- oder Calcium-Ionen aufwies, aber nicht für Anionen. Außerdem zeigten wir mit Membranpotenzial-Messungen an Oozyten und HEK-Zellen, dass das Membranpotenzial dieser ChR2-exprimierenden Zellen sehr schnell und reversibel durch blaues Licht in positive Richtung verändert, beziehungsweise depolarisiert werden konnte. Damit war auch „Nicht-Elektrophysiologen“ sofort klar, dass ChR2 ein neuartiges Werkzeug war, mit dem sich insbesondere elektrisch erregbare Zellen manipulieren ließen.
Aber warum beschäftigten wir uns überhaupt mit so einem obskuren Algenprotein?
Die Entdeckung der Channelrhodopsine basiert auf zwei ganz unterschiedlichen Forschungsfeldern: Biophysik und Algenforschung.
Beginnen wir mit der Biophysik, da ich diese Untersuchungen damals am Max-Planck-Institut (MPI) für Biophysik in Frankfurt anstellte. Die Experimente mit Channelrhodopsinen waren eine logische Fortführung der Analyse von Licht-aktivierten Proteinen, die mit Bacteriorhodopsin (BR) begonnen hatte. Ich war damals Gruppenleiter am MPI, an dem Ernst Bamberg, Direktor der Abteilung Biophysikalische Chemie, seit circa zwanzig Jahren in bahnbrechenden Arbeiten (meist mit Dieter Oesterhelt vom MPI für Biochemie in München) die elektrischen Eigenschaften von Bacteriorhodopsin und weiteren Rhodopsinen untersuchte.
Bereits Anfang der 1970er Jahre hatten Oesterhelt und Stoeckenius gezeigt, dass BR eine Licht-getriebene Protonenpumpe ist, die Energie von Photonen nutzt, um H+-Ionen gegen einen elektrochemischen Gradienten über die Membran aus der Zelle zu transportieren. BR stammt aus dem Archaeum (Archaebacterium) Halobacterium salinarum und ist ein ganz besonderes Membranprotein, das „unkaputtbar“ ist. BR ist einfach aus der Membran von Halobacterium salinarum zu gewinnen und behält, bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahrt, über Jahre seine Funktion – solange es gegen den Verdau durch Mikroben geschützt ist. Deswegen ist BR ein hervorragendes Substrat für Physiker, die mit unterschiedlichen, vor allem spektroskopischen Methoden die Protein-Struktur sowie Licht-induzierte Konformations-Änderungen aufklärten.
Für die Untersuchung des H+-Transports boten sich elektrische Messungen von BR an, das Bamberg in künstliche Lipidmembranen (Black Lipid Membrane, BLM) einbaute. Es war jedoch nicht möglich, BR zu hundert Prozent gleich ausgerichtet in die BLM zu integrieren, sodass alle Proteine ihr Substrat H+ nur in eine Richtung transportierten. Deshalb waren eindeutige Aussagen zur Potenzial-Abhängigkeit des Transports nicht möglich.
Mittlerweile war die DNA-Sequenz für BR jedoch bekannt und Georg Büldts Gruppe am Institut für komplexe Systeme des Forschungszentrums Jülich exprimierte BR schließlich in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe. Die Transport-Funktion des gereinigten Proteins wurde wiederum in BLMs am MPI für Biophysik nachgewiesen. Damit war BR erstmals in die Membranen eukaryotischer Zellen integriert worden.
Da Hefezellen sehr klein sind und eine Zellwand besitzen, beschlossen Ernst Bamberg und ich, BR in Oozyten von Xenopus zu exprimieren, die als System zur Expression von Membranproteinen und ihrer elektrophysiologischen Charakterisierung etabliert waren. Dieser Ansatz funktionierte auf Anhieb. 1995 konnten wir erstmals eine elektrophysiologisch gewonnene Messung der Spannungsabhängigkeit des Licht-aktivierten Transports durch BR präsentieren [3].
Dies hätte bereits der Beginn der Optogenetik sein können, da die Belichtung von BR zu einem Auswärtstransport positiver Ladung führte – und damit zu einem negativeren Membranpotenzial der Zelle (Hyperpolarisation). Auf unseren Hinweis hin wurden ähnliche Proteine tatsächlich viel später (ab 2007) zur Licht-induzierten Inhibierung von Nervenzellen genutzt. Ein Grund hierfür mag gewesen sein, dass wir in unserem FEBS Letters-Paper keine Potenzialmessungen zeigten und BR damals vor allem als Photosynthese-Protein gesehen wurde, das die Energie von Photonen in elektrochemische Energie umwandelt.
Bereits seit mehr als 150 Jahren untersuchen Biologen, wie Algen auf Licht reagieren. Viele Algen schwimmen bei schwachem Licht zu diesem hin (positive Phototaxis) und weichen hohen Lichtintensitäten aus (negative Phototaxis). Es gab auch begründete Vermutungen, dass das Licht von einem Photorezeptor in der Nähe des sogenannten Augenflecks (eye spot) wahrgenommen wird. Bereits 1984 hatten Ken Foster und seine Mitarbeiter von der Cornell University, USA, nachgewiesen, dass Mutanten der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii existieren, die nur nach Zugabe von Vitamin A (Retinal) Phototaxis zeigen. Der Chromophor Retinal bindet kovalent an das Protein Opsin, wodurch Rhodopsin entsteht.
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Dies war ein starker Hinweis darauf, dass Rhodopsin als Photorezeptor agiert – er wurde aber nur von wenigen ernst genommen. Zu diesen gehörte Peter Hegemann, der als Postdoc ein Jahr lang bei Foster alles zu Chlamydomonas reinhardtii gelernt hatte und damals am MPI für Biochemie in Martinsried eine Gruppe leitete – bevor er 1993 Professor für Biochemie an der Universität Regensburg wurde.
Hegemann schloss aus Phototaxis-Messungen mit „blinden“ Chlamydomonas-Mutanten und Retinal-Analoga, dass Rhodopsin ähnlich zu BR (microbial rhodopsin) und nicht homolog zu tierischen Rhodopsinen sein sollte. Er übernahm zudem eine elektrische Messmethode für Grünalgen von Oleg Sineschekovs Gruppe an der Moscow State University. Aufgrund dieser Messungen postulierte er, dass Rhodopsin ein Licht-gesteuerter Ionenkanal oder ein eng mit einem Ionenkanal verbundener Photorezeptor ist.
Versuche, dieses Rhodopsin zu reinigen und/oder zu klonieren, erwiesen sich jedoch als schwierig. 1995 veröffentlichte Hegemanns Gruppe nach Experimenten mit radioaktivem Retinal „Chlamyrhodopsin“[4], das später wegen alternativen Splicings in Chlamyopsin-1 und Chlamyopsin-2 umbenannt wurde. Die Sequenz von Chlamyrhodopsin sollte Ähnlichkeiten zu Invertebraten-Rhodopsin aufweisen, ließ aber keine Modellierung der Rhodopsin-typischen sieben Transmembran-Helices zu und war mit einem Lysin-Gehalt von über fünfzehn Prozent sehr positiv geladen – völlig untypisch für Rhodopsine.
Hegemann schickte die DNA an verschiedene Gruppen zur heterologen Expression, aber niemand konnte damit Licht-Effekte auf die Membran-Permeabilität nachweisen. Nachdem die „Entdecker“ selbst feststellen mussten, dass sich die Phototaxis von Chlamydomonas nicht änderte, wenn Chlamyrhodopsin ausgeschaltet wurde, durchsuchten sie 2001 eine japanische Datenbank von Chlamydomonas-Expressed Sequence Tags (cDNA aus RNA-Sequenzen) nach Rhodopsin-Homologen. Suneel Kateriya von Hegemanns Gruppe fand schließlich zwei Sequenzen, die BR ähnelten – mit über 700 Aminosäuren aber viel länger waren als BR (261aa). Die beiden DNA-Sequenzen landeten schließlich bei mir in Frankfurt. Hegemann nannte sie vorläufig Chlamyopsin-3 und Chlamyopsin-4, obwohl sie nur zu BR und nicht zu Chlamyopsin-1 oder -2 homolog waren.
Nach Umklonierung, In-vitro-Herstellung von RNA, Injektion in Oozyten und anschließender Expression startete ich Versuche zur Membran-Permeabilität bei Belichtung. Leider begann ich meine Experimente mit dem sehr schlecht zu exprimierenden Chlamyopsin-3, konnte die Licht-gesteuerte Kanal-Funktion, besonders für Protonen, aber eindeutig zeigen [2]. Deshalb überzeugte ich auch Peter Hegemann, das neue Protein nicht Chlamyopsin-3, sondern Channelopsin-1 zu nennen.
Mit der Charakterisierung von Channelrhodopsin-2, das deutlich höhere Photoströme zeigte, wurde dann alles viel einfacher [1]. Ab 2004 kamen vermehrt Anfragen nach der ChR2-DNA, in den Folgejahren erschienen fünf Publikationen zur Anwendung von ChR2 in Nervenzellen. Diese waren vollkommen unabhängig voneinander entstanden, basierten aber auf unserer Veröffentlichung von Ende 2003. Die erste dieser Publikationen entstand durch unsere Kollaboration mit Karl Deisseroth [5].
Deisseroth will in seinen Reviews gern den Eindruck vermitteln, dass ChR2 als optogenetisches Werkzeug nur aufgrund seines Papers Einzug in die Neurophysiologie hielt. Dass ihm das recht gut gelungen ist, liegt nicht zuletzt an einem Klonierungsfehler, der mir unterlief, nachdem ich eine Zusammenarbeit mit Alexander Gottschalk, damals Junior-Professor an der Universität Frankfurt, begonnen hatte. Wir wollten ChR2 in Muskelzellen des Fadenwurms C. elegans exprimieren – unsere ersten Versuche waren aber durchweg Kontroll-Messungen, weil die Würmer nur das gelb fluoreszierende Protein (YFP) und kein ChR2::YFP enthielten.
Nachdem ich den Fehler bemerkt und ChR2::YFP (bereits die besser exprimierende Mutante H134R mit größeren Photoströmen) in Muskelzellen von C. elegans eingeschleust hatte, war alles ganz einfach: Die Würmer kontrahierten erstmals auf Belichtung. Und als Gottschalk ChR2 in bestimmten Neuronen exprimierte, konnten wir auch einen nicht gegebenen mechanischen Reiz simulieren, indem wir den Wurm belichteten.
Wir publizierten diese erstmals beobachtete, vollständig nicht-invasive Manipulation des Nervensystems eines lebenden Tieres durch Belichtung mithilfe von ChR2 wenige Monate nach dem Paper von Boyden et al. 2005 [6]. In einer Zusammenarbeit mit André Fiala, damals an der Universität Würzburg (jetzt Universität Göttingen), folgte danach eine Studie zum Licht-induzierten „falschen Lernen“ von Drosophila-Larven [7] – anschließend begann das Optogenetik-Feld zu explodieren.
Ach ja, ich wollte noch die drei anderen unabhängig voneinander erstellten Arbeiten mit ChR2 in Nervenzellen erwähnen: Stefan Herlitzes Gruppe, damals an der Case Western Reserve University, USA, jetzt an der Ruhr-Universität Bochum zeigte, dass die Expression von ChR2 zuverlässig die Licht-induzierte Auslösung von Aktionspotenzialen bis zu einer Frequenz von 20 Hz erlaubt [8]. Die von mir modifizierte ChR2-DNA erhielt er von Peter Hegemann.
Das Team von Hiromu Yawo von der Tohoku University in Japan beobachtete ebenfalls die schnelle Licht-induzierte Auslösung von Aktionspotenzialen in verschiedenen Nervenzellen, Gehirnschnitten und lebenden Tieren [9]. 2004 habe ich dem Erstautor Ishizuka die aus Japan erhaltene, aber von mir modifizierte DNA geschickt.
Die fünfte Publikation, die von Zhuo-Hua Pans Gruppe von der Wayne State University in Detroit stammte, erschien erst 2006 in Neuron – ein Abstrakt davon aber bereits einige Zeit früher. Diese Studie war also mit Sicherheit nicht von Boyden et al., 2005 beeinflusst, sondern durch Nagel et al., 2003. Pans Team nutzte ChR2::GFP, um bei blinden Mäusen wieder eine Antwort auf visuelle Reize auszulösen [10] – ein Riesenschritt auf dem Weg zur Wiederherstellung des Sehvermögens (visual restoration). Übrigens rechnete Pan nicht damit, von mir die ChR2-DNA sofort zu erhalten und ließ sie deswegen für 10.000 US-Dollar synthetisieren (persönliche Mitteilung), was heute circa 200 US-Dollar kosten würde!
Auch interessant: Das eigentliche Algenprotein ChR2 ist 737 Aminosäuren lang. Wie von mir 2003 gezeigt, reichen aber 315 Aminosäuren für die Licht-induzierte Kationen-Leitfähigkeit. Dieses verkürzte Konstrukt wird auch von allen Forschungsgruppen als ChR2 benutzt. Ein DFG-Antrag, mit dem ich die Funktion der restlichen, mehr als 400 Aminosäuren untersuchen wollte, wurde nicht bewilligt – wäre vermutlich zu sehr „reine Algenforschung“. Wofür was die 400 Aminosäuren gut sind, wird wohl noch länger ein Geheimnis bleiben und Anlass zu Spekulationen geben.
Optogenetik umfasst heutzutage auch andere Licht-gesteuerte Proteine. So fanden Forscher zum Beispiel hochspezifische Anionen-Kanalproteine, daneben mikrobielle Adenylat- und Guanylat-Cyclasen sowie Phosphodiesterasen (für Licht-reguliertes cAMP und cGMP). Eine Domäne des pflanzlichen Blaulicht-Rezeptors Phototropin (LOV2) wird in der synthetischen Biologie für spannende Anwendungen genutzt. Auch der pflanzliche Rotlicht-Rezeptor Phytochrom taucht immer häufiger in der Optogenetik auf.
Channelrhodopsin-2, und hier meist die Mutante H134R, ist aber noch immer das meistgenutzte optogenetische Werkzeug.
[1] Nagel, G. et al., Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel, PNAS 100 (24):13940-5
[2] Nagel, G. et al., Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae, Science 296 (5577): 2395-8
[3] Nagel, G. et al., Functional expression of bacteriorhodopsin in oocytes allows direct measurement of voltage dependence of light induced H+ pumping, FEBS Lett. 377 (2): 263-6
[4] Deininger, W. et al., Chlamyrhodopsin represents a new type of sensory photoreceptor, EMBO J. 14 (23): 5849-58
[5] Boyden, E.S. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity, Nat Neurosci. 8 (9): 1263-8
[6] Nagel, G et al., Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses, Curr Biol. 15 (24): 2279-84
[7] Schroll, C. et al., Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae, Curr Biol. 16 (17): 1741-7
[8] Li, X. et al., Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin, PNAS 102(49):17816-21
[9] Ishizuka, T. et al., Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels, Neurosci Res. 54(2):85-94
[10] Bi, A. et al., Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration, Neuron. 50(1):23-33.
Georg Nagel ist seit 2004 Professor für Molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik an der Universität Würzburg. Zusammen mit Peter Hegemann von der Humboldt Universität Berlin begründete er die Optogenetik als neue Disziplin der Biowissenschaften.