TÜBINGEN: Mehr als 25 Jahre nach der Entdeckung des Gens KNOLLE identifizieren Gerd Jürgens und sein Team dessen evolutionären Ursprung und seinen besonderen Beitrag zur Entwicklung von Pflanzen.
Manchmal dauert es Jahre, bis man von der Oberfläche eines biologischen Phänomens auf den molekularbiologischen Grund gelangt. Davon erzählt dieser Journal Club aus dem Labor von Gerd Jürgens in Tübingen.
1991 mutagenisierte der Entwicklungsgenetiker Jürgens, der damals an der Ludwig-Maximilians-Universität (LMU) in München tätig war und sich gerade von der Drosophila-Forschung losgesagt hatte, Samen von Arabidopsis thaliana. Er und sein Team suchten nach Keimlingen mit gestörter Embryonalentwicklung – und fanden die heute unter Entwicklungsbiologen allseits bekannten, radikalen Phänotypen gurke, fackel und gnom sowie zwei Mutanten mit radialen Musterdefekten, nämlich knolle und keule (Nature 353: 402-7).
Die Keimlinge der knolle-Mutanten sind klein und rund, ähnlich wie eine Mini-Kartoffel. Als die Forscher genauer hinsahen, stellten sie fest, dass die epidermalen Vorläuferzellen von den Zellen im Inneren des Embryos morphologisch nicht zu unterscheiden sind. Keule-Keimlinge sind dem Wildtyp etwas ähnlicher, haben allerdings unregelmäßig geformte, überdimensional große epidermale Zellen.
Mit dieser Abbildung in Nature (335: 402-7) fing alles an: Arabidopsis-Mutanten mit radikalen Phänotypen im Keimlingsmuster – f und g sind knolle und keule. Näheres siehe Text. Foto: Ulrike Mayer / Nature
Fünf Jahre danach publizierten Jürgens und seine Mitarbeiter, dass sowohl die KNOLLE- als auch KEULE-Gene an der Zellteilung beteiligt sind. Mutationen in beiden Genen beeinträchtigen die Bildung der Zellplatte, die sich zwischen zwei Tochterzellen von der Mitte nach außen hin bildet. Zellplatten sind spezifisch für die Cytokinese von Pflanzen. Denn bei einer tierischen Zelle bildet sich zur Teilung ein kontraktiler Ring, der die Zelle von der Oberfläche her einschnürt. Pflanzenzellen hingegen synthetisieren im Zellinneren eine neue Membran, die von der Mitte der Zelle nach außen hin konzentrisch wächst. Vesikel, die aus dem Golgi-Apparat abgeschnürt werden, bewegen sich zur Zellteilungsebene und verschmelzen dort miteinander zu einer Art „Schweizer Käse-Scheibe“, wie Jürgens sagt.
1997 veröffentlichten die mittlerweile nach Tübingen umgezogenen Forscher, dass KNOLLE für ein SNARE-Protein kodiert (J. Cell. Biol. 139: 1485-93). SNARE-Proteine steuern die Fusion von Membranvesikeln in tierischen Zellen, das wusste man schon damals. Den Ergebnissen nach zu urteilen, anscheinend aber auch in Pflanzen. KEULE hingegen sollte sich 2001 als ein regulatorischer Kofaktor von SNARE-Proteinen entpuppen (J. Cell. Biol. 152: 531-43).
Da KNOLLE also eine entscheidende Funktion im Wachstum einer Pflanze hat, fragten sich die Forscher: Wie kann eine Mutante dann überhaupt noch ihre Zellen teilen und ziemlich intakte Zellplatten bilden? Und wie können niedere Pflanzen wie Moose und Farne, die gar kein KNOLLE-Gen haben, eine konventionelle Zellteilung wie Angiospermen schaffen? Welche Mechanismen übernehmen die lebenswichtige KNOLLE-Funktion zumindest teilweise und kompensieren dessen Ausfall in den Mutanten?
Misoon Park, Postdoktorandin bei Jürgens seit mehreren Jahren, und seit 2013 im Projekt involviert, erzählt: „Mit diesen Fragen im Kopf hatte die ehemalige Doktorandin Ilke Reichardt Experimente durchgeführt und 2011 einen Kandidaten gefunden, der KNOLLE ersetzen kann, nämlich SYP132.“ (Traffic 12: 1269-80). Auch SYP132 codiert für ein SNARE-Protein.
Das Projekt gestaltete sich unerwartet schwierig. Zwar gibt es von A. thaliana Tausende von T-DNA-Linien und für so ziemlich jedes Gen eine T-DNA-Mutante, aber mit SYP132 hatten die Tübinger Pech: Sie fanden nur eine Promotor-Mutante mit schwachem Phänotyp. Also versuchten sie, mittels TILLING (abgekürzt von „Targeting Induced Local Lesions in Genomes“) Punktmutationen zu kreieren – auch ein Fehlschlag. „Wir hatten schon einfachere Projekte“, grummelt Jürgens.
Also dachten die Forscher um. Reichardt probierte es schließlich mit künstlichen kleinen microRNAs, so genannte amiRs. Die amiR(SYP132)-Moleküle reduzierten zwar wie erwartet die Bildung von SYP132-Protein, der Phänotyp blieb jedoch sehr schwach. Entnervt kreuzten die Forscher schließlich die Promotermutante mit der amiR-Pflanze – und fanden einen richtig guten Phänotyp. Für die Pflanze ist dieser natürlich eher unvorteilhaft, da die Keimlinge nicht überlebensfähig sind. Die Forscher hingegen hatten endlich Material, mit dem sie weiter arbeiten konnten. Und so entdeckten sie schließlich, dass KNOLLE und SYP132 zwar ähnliche, aber eben nicht identische Funktionen bei der Zellteilung haben (Dev. Cell 44: 500-11e4).
Was beide Proteine gemein haben: Sie bilden während der Cytokinese mit ihren Partnern zwei Arten von SNARE-Komplexen – ein Trimer und ein Tetramer. Denn SNARE-Proteine arbeiten nie solo, sondern nur im Team mit anderen Proteinen. Sie bilden Brücken zwischen benachbarten, aber noch nicht vereinten Membranpartikeln und unterstützen damit deren Verschmelzung.
Allerdings haben die beiden SNARE-Proteine unterschiedliche Aufgaben. Im Gegensatz zu SYP132 ist KNOLLE für die Zellularisierung im Endosperm, dem extraembryonalen Nährgewebe, notwendig. Knolle-Mutanten bilden zwar uneingeschränkt neue Zellkerne, doch können sie diese im Gegensatz zum Wildtyp dann nicht mehr in eigene Zellen einschließen. SYP132 kann diese Zellularisation nicht unterstützen. Dagegen akkumuliert SYP132 – anders als KNOLLE – auch während der Interphase und fördert die Fusion sekretorischer Vesikel mit der Plasmamembran.
Weil sie in niederen Pflanzen und auch schon in Algen nur SYP132 finden, nahmen die Forscher an, dass dieses Gen älter als KNOLLE und für Zellteilung und sekretorische Vesikelfusion zuständig sein musste. „Mit der Entstehung der Blütenpflanzen hat dann vermutlich eine Genduplikation stattgefunden, die den komplizierten Besonderheiten ihrer Samenentwicklung und der Entstehung des Endosperms Rechnung trägt“, meint Jürgens.
Ist damit die KNOLLE-Geschichte nun zu Ende erzählt? „Eher nicht“, sagt Jürgens. Der Entwicklungsgenetiker ist zwar inzwischen knapp 69 Jahre alt, denkt aber nicht daran, sich auf sein Altenteil zurückzuziehen. „Ich werde noch einige Jahre als Seniorprofessor aktiv bleiben.“ Auch die Postdoktorandin Park hat mit KNOLLE noch nicht abgeschlossen: Sie will genauer untersuchen, wie die Fusion der Membranvesikel vonstattengeht. Das herauszufinden, dauert hoffentlich nicht noch einmal 25 Jahre.