BAYREUTH/BONN: In der Optogenetik kommen auch Proteine zum Einsatz, die lichtabhängig an DNA binden. In einem Kooperationsprojekt ist nun ein erster Schritt gelungen, diese Technik auf RNA-Moleküle auszuweiten..
Das Verhalten von Zellen oder sogar ganzer Organismen alleine mithilfe von Licht zu steuern, ist ein Traum vieler Forscher. Tatsächlich hält die Optogenetik dafür schon viele Werkzeuge bereit. LOV (Light, Oxygen, Voltage)-Proteindomänen beispielsweise nehmen blaues Licht wahr und lassen sich biotechnologisch an Effektordomänen wie Histidinkinasen oder Adenylatcyclasen koppeln, wodurch deren Aktivität lichtabhängig wird.
LOV-Proteine mechanistisch zu verstehen und sie für ihren optogenetischen Einsatz fit zu machen, sind Ziele von Andreas Möglich von der Universität Bayreuth. Auf der Suche nach LOV-Domänen mit neuen Eigenschaften stieß der Photobiochemiker im Actinobakterium Nakamurella multipartita auf eine Proteinvariante namens PAL, die eine Effektordomäne mit RNA-Bindefähigkeit besitzt – ein Novum, denn bisher war kein einziges Protein bekannt, das lichtabhängig RNA reguliert. Wofür PAL steht, dazu später mehr.
Die Bayreuther erkannten das Potenzial des neuartigen Proteins und wandten sich an Günter Mayer von der Universität Bonn. Dieser kennt sich bestens mit RNA-Molekülen aus – wie auch mit Aptameren, deren dreidimensionale Struktur Proteinen als Bindemotiv dient. In seinem Projekt „OptoRibo“, das der European Research Council mit einem Consolidator Grant fördert, sucht Mayer gezielt nach Werkzeugen, um Funktionen von RNA-Molekülen in Zellen zu kontrollieren – und war deshalb begeistert davon, bei der Charakterisierung von PAL zu helfen: „Wir sollten die RNA-Motive finden, die PAL bindet“, erklärt der Chemiker. „Das war für uns eine spannende Aufgabe, denn die Verbindung von einer LOV- zu einer RNA-Bindedomäne ist etwas völlig Neues. Zudem hat PAL für ein LOV-Protein eine ungewöhnliche Architektur.“ Die Zusammenarbeit der beiden Forscherteams wurde jetzt mit einer gemeinsamen Publikation belohnt (Nat. Chem. Biol., doi: 10.1038/s41589-019-0346-y).
Doch zurück zum (LOV-)Normalfall: LOV-Domänen nehmen Blaulicht über ein Flavin-Nukleotid, meist Flavin-Mononukleotid (FMN), wahr. Der Flavin-Anteil bildet daraufhin eine Thioetherbindung zu einem konservierten Cystein aus, wodurch im Protein eine Konformationsänderung ausgelöst wird. Diese überträgt das Lichtsignal auf eine C-terminal nachgeschaltete Effektordomäne. Normalerweise befinden sich LOV-Domänen also N-terminal und sind mit einer für die Signalübertragung wichtigen α-Helix (Jα) mit der C-terminalen Effektordomäne verbunden.
Bei PAL ist letztere eine AmiR-and-NasR-Transcription-Antitermination-Regulator-Domäne, kurz ANTAR-Domäne. „ANTAR-Domänen erkennen dreidimensionale RNA-Strukturen, binden daran und regulieren dadurch den Transkriptionsabbruch“, so Mayer. Außerdem findet sich in PAL noch eine PAS (Per-ARNT-Sim)-Domäne, die laut Mayer vermutlich hauptsächlich stabilisierende Funktion besitzt und für die dimere Struktur des PAL-Proteins wichtig ist. Die Domänenanordnung (PAS-ANTAR-LOV) erklärt einerseits den Namen des neuen Proteins, offenbart andererseits aber auch gleich seine architektonische Besonderheit: Bei PAL befindet sich die LOV-Domäne am C-Terminus des Proteins, sodass die für die Signalübertragung wichtige Helix Jα nicht mehr zwischen Lichtrezeptor- und Effektordomäne liegt. Wie also funktioniert dieses ungewöhnliche Protein?
Um Licht in die Sache zu bringen, produzierten Möglich und Mitarbeiter PAL in E. coli. Das heterolog exprimierte Protein bildete ein Homodimer, zeigte eine intakte Lichtsensorik und band unspezifisch verschiedene RNA- und DNA-Sequenzen. Eine spezifische Bindung an Liganden von anderen ANTAR-Domänen konnten die Forscher dagegen nicht zeigen. An dieser Stelle kam Mayer ins Spiel, der in seinem Labor SELEX, eine Methode zur iterativen Anreicherung von RNA-Bindungspartnern, perfektioniert hat.
Dafür erstellten die Bonner im ersten Schritt eine Bibliothek aus vierzig Nukleotide langen RNA-Fragmenten, die „mit 1015 unterschiedlichen Sequenzen eine kaum vorstellbare Vielfalt“ aufweist, wie Mayer nicht ohne Stolz berichtet. „Aus dem RNA-Gemisch wurden dann diejenigen herausgefiltert, die PAL unter Blaulicht am stärksten binden.“ Da PAL immobilisiert ist, können alle nicht gebundenen Sequenzen leicht weggewaschen werden. Gebundene Sequenzen wurden durch RT-PCR vermehrt und in den nächsten Zyklus eingesetzt. „Nach neun Zyklen haben wir ein erstes Bindemotiv gefunden“, so Mayer. „In den folgenden sechs Zyklen erhöhten wir graduell die Stringenz, indem wir das Volumen des Waschpuffers vergrößerten und die Menge an PAL und RNA verringerten. Auf diese Weise werden die Sequenzen angereichert, die besonders lange an PAL gebunden bleiben – in diesem Fall das Bindemotiv 2.“ Beide Motive bilden Haarnadelschleifen mit ähnlicher Struktur. Auf die Länge der Haarnadeln von 17 beziehungsweise 19 Nukleotiden gestutzt, banden diese RNA-Aptamere spezifisch und lichtabhängig an PAL. Dabei wies jedes PAL-Dimer eine einzige Bindestelle auf, um die die beiden Bindemotive konkurrierten.
Bisher beschriebene ANTAR-Liganden bestehen dagegen aus zwei hintereinanderliegenden Haarnadelschleifen. Die Bindungsstärke zwischen Aptamer und Protein bestimmte das Forscherteam unter anderem mit der Fluoreszenzpolarisation, bei der beide Komponenten in Lösung vorliegen, was dem natürlichen System sehr nahekommt. „Dazu wird die Haarnadelschleife des Aptamers mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt“, erläutert Möglich das Messprinzip. „Linear polarisiertes Licht wird durch den Fluorophor absorbiert und darauf emittiert, was abhängig von der Rotation des Fluorophors zu einem messbaren Verlust der initialen Polarisation führt. Die Bindung eines großen Moleküls wie PAL verändert die Rotation des Fluoreszenz-markierten RNA-Moleküls und damit die messbare Polarisation.“ Für PAL ergaben sich auf diese Weise unter Blaulicht Dissoziationskonstanten (KD-Wert) im Bereich von 10 nM, was auf eine starke Bindung der Aptamere hinweist. Hingegen betrug die Affinität im Dunkeln weniger als 2 µM.
Um dem Bindemechanismus auf die Spur zu kommen, erstellte Möglichs Team eine Kristallstruktur von PAL im Dunkeln, also in der weniger aktiven Form. Eine ungewöhnliche Struktur aus einer α-Helix und einem Prolin-reichen Linker am C-Terminus der ANTAR-Domäne erregte die Aufmerksamkeit der Forscher. „Es handelt sich dabei um eine Übergangsstruktur, also einen Adapter, zwischen Effektor- und Rezeptordomäne“, erklärt Möglich. „Die für den Mechanismus wichtige Helix Jα wechselwirkt mit der Kontaktfläche von ANTAR und Adapter.“
Dass die am C-Terminus, noch hinter der LOV-Domäne liegende Helix Jα Kontakt mit dem Adapter aufnehmen kann, wird durch den langen flexiblen Linker des Adapters ermöglicht. Durch die Interaktion blockiert Jα im Dunkeln vermutlich die RNA-Bindung durch die ANTAR-Domäne. Unter Blaulicht-Bedingungen wird diese Hemmung aufgehoben, wie der Biochemiker darlegt: „Vermutlich führt die im Hellen ausgelöste Konformationsänderung dazu, dass sich zum einen die beiden Chromophore des PAL-Dimers annähern und zum anderen die Helix Jα ausgeklappt wird. Dadurch wird ANTAR für seine Liganden zugänglich.“
Da die Struktur der aktiven Proteinform noch unbekannt ist, handelt es sich erstmal um ein Modell, das jedoch durch zahlreiche Daten aus der Bayreuther Gruppe gestützt werde, wie die beiden Gruppenleiter betonen. „Und zumindest die Annäherung der Chromophore konnten wir ja bereits in Zusammenarbeit mit Robert Bittl vom Institut für Experimentalphysik der Freien Universität Berlin zeigen“, fügt Mayer hinzu.
Die Hellstruktur von PAL steht trotzdem noch auf Möglichs To-do-Liste: „Die Struktur von PAL im Licht und am besten mit gebundener RNA wäre für uns extrem wertvoll, und wir arbeiten daran. Allerdings ist die Kristallisation unter Licht bislang noch nie für ein Protein mit vergleichbarer Komplexität gelungen. Bereits die Aufklärung der Dunkelstruktur von PAL war methodisch sehr anspruchsvoll.“
Dass PAL tatsächlich in der Lage ist, RNA-Funktionen zu regulieren, zeigten Mayer und Möglich als Ausblick am Ende ihrer Publikation. Zuerst bauten sie ihr Aptamer mit Bindemotiv 1 vor eine Shine-Dalgarno-Sequenz eines Reportertranskripts und zeigten, dass dessen Expression in E. coli in der Anwesenheit von PAL sank, sobald es mit Blaulicht bestrahlt wurde. Wie erwartet war für die Bindung an das Transkript eine intakte ANTAR-Domäne erforderlich, für die Lichtabhängigkeit hingegen eine intakte LOV-Domäne.
Im letzten Schritt bewiesen sie noch, dass das Ganze auch in Säugerzellen funktioniert, wofür sie einen Luciferase-Reporter verwendeten, der im 5‘-untranslatierten Bereich das Aptamer mit Motiv 2 trug. Damit scheint PAL tatsächlich für Anwendungen in der Optoribogenetik prädestiniert. „Ein Protein mit den Eigenschaften von PAL war bisher weder aus der Natur bekannt, noch wurde eines gentechnisch hergestellt“, zeigt sich Mayer begeistert. „Dafür gibt es ein enormes Anwendungspotenzial, wenn man bedenkt, dass 75 Prozent aller Transkripte in Säugern nicht translatiert werden.“ Während Mayer in Zukunft versuchen möchte, mit PAL Funktionen von weiteren RNA-Systemen wie microRNAs oder CRISPR/Cas in eukaryotischen Zellen und Tiermodellen zu manipulieren, richtet Möglich sein Augenmerk mehr auf Struktur und Funktion von PAL im ursprünglichen Organismus: „Denn dort sind die Bindemotive und damit die natürlichen Ziele noch immer unbekannt.“