Hybridisierungsphilosophien

von Cornel Mülhardt

"Es gibt noch Wunder auf dem deutschen Buchmarkt", schrieb neulich ein Kritiker und meinte die kultverdächtige Experimentator-Serie des Spektrum /Gustav Fischer Verlags. Wir sind der gleichen Meinung, und dies nicht nur, weil einer der Experimentator-Autoren bei Laborjournal arbeitet. Geplagt und gejagt von Neuauflagen - beim Proteinchemie-Experimentator steht schon die dritte an, der Molekularbiologie-Experimentator, erst Anfang dieses Jahres herausgekommen, ist fast ausverkauft - haben die Autoren sich breitschlagen lassen, regelmäßig in Laborjournal über neue Methoden zu berichten. Den Anfang macht Cornel Mülhardt, Autor des Molekularbiologie-Experimentators. Nun ist aber niemand allwissend. Vielleicht verfügen Sie ja bei der einen oder anderen Methode über tiefere Erkenntnisse oder kennen bessere Tricks. Schreiben Sie uns einen kurzen (!) Kommentar. Falls er uns einleuchtet, wird er in der nächsten Ausgabe gedruckt. Dies ohne externe Begutachtung, und daher ohne Gutachterärger. So schnell können Sie nirgends Priorität für eine neue oder verbesserte Methode anmelden!

Ich liebe Hybridisierungen. Und das kam so: In grauer Vorzeit (wie mir scheint), als ich noch Wochenenden im Labor verbrachte, hatte ich recht viel zu hybridisieren. Southern, Northern, und wenn ich schon mal dabei war, hier und da auch mal einen kleinen Dot blot. Der schlimmste Moment war immer, wenn die Flasche mit dem Hybridisierungspuffer sich ihrem Ende neigte. Dann hieß es, das alte Protokoll herauszukramen und die dumpfen Erinnerungen an die Zusammensetzung dieser magischen Lösung aufzufrischen. Bei mir stand da: 5 x SSC, 5 x Denhardt's, 25 mM NaP04 pH 7.4, 1 mM Na-Pyrophosphat, 1 % SDS, 100 µg/ml einzelsträngige Heringssperma-DNA.

Höchst komplex, höchst zeitraubend und einen hohen Grad von Organisation voraussetzend, solche Anleitungen. Zu den klassischen Problemen gehörten die Fragen "Was ist Denhardt's?" oder "Weißtu, wo das Heringssperma is?" im Minus Zwanziger im Gang, ganz unten." Trabtrab, quietsch, zieh - nix. Drück, wump, trabtrab. "Da is'aber nix." "Dann ham wir nix mehr. Mußdu neues machen." Heringssperma-DNA bestellen, HeringsspermaDNA kleinhäckseln ("Wo ist denn der Sonicator?"), Heringssperma-DNA portionieren, da konnte gut und gerne eine Woche draufgehen. Mit den anderen Komponenten war es ähnlich, wenngleich nicht ganz so nervig.

Großes Arbeitssparpotential also. Tatsächlich kamen mir im Laufe der Zeit auch andere Protokolle unter die Finger. Als passionierter Labornahkämpfer interessierte mich immer, ob sich dadurch Arbeit und Zeit sparen ließe. Und siehe da, ich wurde durchaus fündig, die Zahl der Varianten war beträchtlich. So schwankten die Mengen an SSC oder SDS zum Teil deutlich, und manchmal wurde auf den Phosphatpuffer oder das Pyrophosphat verzichtet. Die erstaunlichste Entdeckung aber gelang mir eines hektischen Abends, als ich auf den letzten Drücker schnell noch eine Hybridisierung ansetzte. Als ich am nächsten Tag die Membran wusch und maß und wusch und maß, strahlte zu meinem Entsetzen auch nach einer halben Stunde intensivsten Waschens mein Southern noch wie eine mittelkleine Atombombe.


Was war geschehen?

Es kostete mich ein Dutzend Neuronen, bis mir wieder einfiel, dass ich das SDS im Prähybridisierungspuffer vergessen hatte. Da das SDS dem Hybridisierungspuffer erst kurz vor dem Gebrauch zugegeben wurde, weil es sonst ausfiel, und aus Gründen der Materialersparnis (siehe oben) der Prähybridisierungspuffer auch als Hybridisierungspuffer weiterverwendet wurde, war die ganze Hybridisierung in Abwesenheit von SDS abgelaufen, mit dem erwähnten Resultat. Wenn die Anwesenheit der gar so wichtigen Heringssperma-DNA, des Pyrophosphats und auch des vermaledeiten Denhardt's die Katastrophe nicht verhindern konnten, konnte man dann nicht daraus den Umkehrschluss ziehen, dass die einzige wirklich wichtige Komponente das SDS war? Natürlich ließ mir dieser Gedanke keine Ruhe, so dass ich noch am gleichen Abend den Beweis startete. Das Ergebnis war verblüffend: Eine viertelstündige Inkubation in 10% SDS blockierte die Nylonmembran höchst effizient, daran änderte selbst die anschließende Hybridisierung im SDS-freien Hybridisierungspuffer nichts mehr. SDS-Lösung ist einfach anzusetzen und noch dazu kann man die Lösung mehrfach zum Blockieren verwenden


Ideal für einen Faulpelz wie mich

Einige Zeit später fand ich den Gedanken dieser Entdeckung dann in einem Hybridisierungspuffer von Boehringer Mannheim (Gott hab' es selig)* wieder (0,5 M NaH2P04 pH 7.2, 1 mM EDTA, 7% SDS). Später wurde das meines Wissens durch etwas Komplizierteres ersetzt; die Gründe dafür sind mir nicht bekannt, denn dieser Einfachpuffer funktionierte durchaus.Heute hat das Problem von seiner Dringlichkeit verloren, weil mittlerweile fast jeder Vertreiber von Molekularbiologika einen Hybridisierungspuffer im Angebot hat, der noch dazu häufig damit lockt, dass die Arbeit viel besser von der Hand geht. Hybridisierungen in einer Stunde statt 4-16, doppelt so viel Signal und halb so viel Hintergrund, verspricht die Werbung. Einziger Wermutstropfen: Die Zusammensetzung dieser Turbopuffer wird nicht verraten. Dadurch lässt sich schwer einschätzen, ob und wie sie funktionieren, der Laborarbeiter ist zum Kaufen und Probieren verdonnert. Ich selbst habe keine Erfahrungen damit, wäre aber für Berichte dankbar. Schlie(section)Iich noch ein Tip für diejenigen, die heute noch aus Kostengründen ihren Hybridisierungspuffer selbst herstellen: Vergesst Ultraschall, vergesst KanüIen, die bequemste Methode, Heringssperma-DNA in kleine, einzelsträngige Stückchen zu zerlegen, besteht darin, das Zeug zu autoklavieren. Grausam, aber effektiv.

Eine andere interessante Entwicklung hat bei der Durchführung der Hybridisierung stattgefunden. Anfangs benutzte man noch Frischhalteboxen aus dem Supermarkt, die ins Schüttelwasserbad gestellt wurden. Eine einfache Angelegenheit. Sie hatte allerdings den kleinen Schönheitsfehler, dass man enorme Mengen an Hybridisierungspuffer benötigte. Also begannen findige Geister, ihre Membranen in Plastikbeuteln einzuschweißen. Eine hervorragende Idee, sofern es gelang, irgendwo ausreichend dicke und hitzebeständige Plastikfolien aufzutreiben. Zudem war dies mit einer Riesensauerei verbunden, weil die kunstvoll selbstkreierten Tütchen am Ende so verschweißt werden mussten, dass möglichst wenig Luftblasen in der Hybridisierungslösung zurückblieben, andererseits die Schweißnaht absolut dicht war. Das Verschweißen zweier nasser Plastikfolien beherrschen aber nur Könner. Bei den vielen Nichtkönnern kam es reihenweise zu strahlenden Fingern, strahlenden Arbeitsplätzen und hoffnungslos kontaminierten Folienschweißgeräten, die in der hintersten Ecke des Isotopenlabors eingebunkert werden mussten. Wer heute noch auf diese Weise schweißt, sei auf die "hybridization bags" von Roche Diagnostics hingewiesen, die auf einer Seite einen Schraubverschluß besitzen, mit dem sich elegant und sauber Hybridisierungspuffer hineingießen und Luftblasen herausdrücken lassen.


MeineLieblingsmethode

ist die Hybridisierung in der Flasche. Die geht sauber und ziemlich einfach. Leider benötigt man dazu einen Drehofen mit passenden Halterungen. Sollte sich im Institut keines dieser meist angestaubten Ungetüme finden, bietet der Fachhandel Kleinöfen und dazu passende Flaschen in allen Formaten zu meist relativ moderaten Preisen (ab ca. 3.000 DM) an. Die Membran in die Flasche zu bringen ist anfangs mühselig, wird aber mit einer ansonsten bequemen Handhabung und mit phänomenal geringem Verbrauch an Hybridisierungslösung belohnt - bei kleinen Flaschen kommt man mitunter mit 5 ml aus. Weil die Membran an der Flascheninnenseite klebt und die Unterseite nur unvollständig mit Lösung bedacht wird, sollte man die Prähybridisierung in der guten alten Frischhaltebox durchführen oder zwischen Membran und Flasche ein Stück Gaze platzieren. Immer sollte die Seite mit der DNA in Richtung Flascheninnenseite liegen, weil sich sonst die Chancen auf eine erfolgreiche Hybridisierung deutlich verringern.




Fazit

Neue Methoden ersetzen die alten selten, sie komplementieren nur. Zum Prähybridisieren und zum Waschen greift man nach wie vor am besten zur Frischhaltebox. Zum Hybridisieren einzelner Membranen eignen sich die Flaschen am besten, während der Plastikbeutel noch immer eine gute Alternative ist, wenn man mehrere Membranen mit der gleichen Sonde hybridisieren möchte. Hybridisierungspuffer gibt's in Hülle und FüIle zu kaufen, und wer sowieso auf ein System zurückgreift, beispielsweise auf ein Kit für nicht-radioaktive Hybridisierung, wird sich zumeist an den vom Hersteller empfohlenen Puffer halten. Dies nicht zuletzt aus Furcht - die Hersteller tun mit Liebe so, als müsse ein Experiment zwangsweise scheitern, wenn man nicht ihre Produkte verwendet.

Angesichts der gesalzenen Preise lohnt es sich, ein wenig Zeit in ein paar Tests zu investieren. Neben den genannten Rezepten kann man sich auch von der Standardliteratur wie Maniatis und Current Protocols in Molecular Biology oder vom Benchnachbarn inspirieren lassen. Nur Mut! Der technische Fortschritt kommt nicht von denen, die sklavisch anderer Leute Protokolle nachkochen.




Letzte Änderungen: 08.09.2004