Lange Zeit gingen Forscher davon aus, dass die Oberflächenplasmonenresonanz-Analyse (SPR) nur im Mikrometer-Maßstab funktioniert. Inzwischen ist die SPR in die Nanowelt vorgestoßen und liefert Aufnahmen biologischer Nanopartikel.
In der Bioanalytik wird die Oberflächenplasmonenresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR) häufig zur Interaktionsanalyse von Biomolekülen, etwa von Antikörpern mit ihren Zielmolekülen, verwendet. Bis vor wenigen Jahren war die klassische SPR jedoch auf die Untersuchung von Partikel beschränkt, die größer sind als ungefähr ein Mikrometer. Die Analyse kleinerer biologischer Nanopartikel war nicht möglich. 2010 gelang es jedoch einer Gruppe um Alexander Zybin vom Leibniz Institut für Analytische Wissenschaften in Dortmund, mit der SPR-Technik die Bindung einzelner Polystyrol-Partikel mit Durchmessern von etwa 40 Nanometern an einen SPR-Sensor zu detektieren. Kurze Zeit später demonstrierte die Gruppe, dass man mit dem SPR-Verfahren auch die Bindung etwa 100 Nanometer-großer HI-Virus-artiger-Partikel an die Sensoroberflächen beobachten kann.
In den USA entwickelte schließlich Robert Corns Mannschaft an der University of California in Irvine im letzten Jahr ein SPR-Imaging Verfahren (SPRI), das die Hybridisierung funktionalisierter DNA-Fragmente darstellt. Damit war der Weg frei für die SPR-Nanoskopie als bildgebendes Verfahren zur Detektion und Visualisierung biologischer Nanopartikel auf Basis der Oberflächenplasmonenresonanz.
Wie funktioniert SPRI? SPRI ist eine markierungsfreie, optische Analysemethode zur visuellen Darstellung der Oberflächenplasmonenresonanz. Diese tritt auf, wenn polarisiertes Licht durch ein Prisma auf einen mit Gold beschichteten SPR-Sensor fällt und von diesem reflektiert wird (Totalreflexion). Passen Wellenlänge, Polarisation und Einfallswinkel zusammen, so regen die Photonen des einfallenden Lichts die freien Elektronen des Goldes zu longitudinalen Schwingungen parallel zur Metalloberfläche an, den sogenannten Oberflächenplasmonen.
„Störungen“ an der Sensoroberfläche verändern die Resonanzbedingungen (Schwingungen). Im Versuchsansatz erreicht man dies durch Interaktionen zwischen immobilisierten Molekülen auf dem Sensor und den fließenden Ziel-Analyten. Auf der Sensoroberfläche bildet sich hierdurch eine Schicht, die die Plasmonenresonanz verändert. Das SPRI-Instrument misst diese Änderungen in Echtzeit und bildet die Bindung der Analyten an die Sensormoleküle mit Hilfe einer CCD-Kamera ab. Da der in Dortmund entwickelte SPR-Sensor auch Nanopartikel detektiert, bezeichnen ihn seine Entwickler auch als Plasmon Assisted Microscopy of Nano-Size Objects-Sensor oder kurz, PAMONO-Sensor.
Schon die Art des Versuchsaufbaus verdeutlicht die Vorteile des PAMONO-Sensors: dieser detektiert nur Signale, die durch die Analyten selbst verursacht werden. So ist im Gegensatz zu anderen Methoden, wie zum Beispiel der PCR, auch eine Quantifizierung möglich. Die Analysedauer ist deutlich kürzer als bei anderen Techniken, im Idealfall liegen die Ergebnisse bereits nach wenigen Minuten vor.
Aufbauend auf ihren SPRI-Versuchen mit Polystyrol-Partikeln untersuchte Zybins Arbeitsgruppe die Eignung der SPR-Bildgebung zur Darstellung von Viren und Virus-ähnlichen Partikeln (Shpacovitch et al., Anal. Biochem., 486, 62-9).
Hierbei interessierte Victoria Shpacovitch als Erstautorin des Papers samt ihrer Kollegen insbesondere, wie die Größe und die Form der Analyten die Messung beeinflussen. Dazu verglichen sie die SPRI-Signale von Polystyrol-Teilchen sowie HI-virusähnlicher Partikel (HIV-VLPs) gleicher Größe und Form. Da die Stärke des Mess-Signals sowohl von der Größe des untersuchten Nanopartikels als auch von dessen Brechungsindex abhängt, konnte Zybins Team problemlos unterscheiden, ob ein Styrolpartikel oder ein VLP an die Sensoroberfläche gebunden hatte.
Das Herzstück des PAMONO-Sensors besteht aus einem goldbeschichten Prisma sowie einer Flusszelle. Die analysierten Nanoteilchen sind in einer Flüssigkeit gelöst und binden in der Flusszelle an die Oberfläche des Sensors. Eine CCD-Kamera visualisiert die detektierten Bindungsereignisse. Foto: Victoria Shpacovitch
Welchen Einfluss die Form auf die Detektion mit der SPRI-Technik hat, untersuchten Zybins Leute, indem sie die Bindung runder inaktivierter Influenza-A-Viren (IAV) mit der von röhrenförmigen Tabakmosaikviren (TMV) verglichen. Die IA-Viren konnte die Gruppe mit dem SPRI-Verfahren eindeutig detektieren und differenzieren. Die länglichen TM-Viren erkannte der Sensor hingegen nicht.
Die genaue Ursache hierfür kennen die Dortmunder noch nicht. Sie vermuten, dass das kleinere Volumen der TM-Viren für die fehlgeschlagene Detektion verantwortlich sein könnte. Möglicherweise ist das Volumen zu gering und liegt unter der Nachweisgrenze. Oder ist doch die Form entscheidend und SPRI funktioniert nicht bei röhrenförmigen Viren?
In einem weiteren Experiment untersuchte die Gruppe, wie sich die Zusammensetzung des Mediums auf das SPRI-Signal auswirkt. Hierzu versetzte sie die HIV-VLP-haltige Lösung zusätzlich mit bis zu 20% fetalem Kälberserum (FBS). Wurde das System hierbei ausreichend lange mit der FBS-Pufferlösung äquilibriert, wirkte sich das zugesetzte FBS nicht auf die Messsungen aus. Da Zellkulturmedien selten mehr als 20% FBS enthalten, ist es mit SPRI also auch möglich biologische Nanopartikel oder Viren in FBS-haltigen Medien zu analysieren.
In früheren Proof-of-Principle-Versuchen hatten Zybins Mitarbeiter bereits winzige Polystyrol-Partikel mit einem Durchmesser von 200 Nanometern mit SPRI anhand der Bindungsraten quantifiziert. Aber funktioniert dies auch mit biologischen Proben? Lässt sich auch hier die Konzentration der Analyte über die SPRI-Bindungsraten ermitteln?
Die Antwort auf diese Frage lieferte eine Verdünnungsreihe aus einer wässrigen HIV-VLP-haltigen Lösung, die mit der SPRI-Technik untersucht wurde. Shpacovitch et al. trugen die Zählraten, die sie für die einzelnen Verdünnungen maßen gegen die HIV-VLP-Konzentration auf und erhielten hieraus eine lineare Kalibrierkurve. Mit dem SPRI-Sensor lassen sich also auch Konzentrationen biologischer Nanopartikel bestimmen – und dies auch in Lösungen, mit bis zu 20% FBS. Die einzige Bedingung hierfür ist, dass die Kalibrierung mit gleichen oder bezüglich Größe, Form und Affinität des funktionalisierten Sensors, ähnlichen Partikeln erstellt wird.
Entscheidend für die zuverlässige Quantifizierung von Analyten ist neben der Sensivität auch die Selektivität der verwendeten Methode. Erfasst das SPRI-Verfahren tatsächlich nur die Ziel-Analyten oder verfälschen andere Probenbestandteile das Ergebnis? Zybin und Co. bestimmten die Selektivität anhand zweier HIV-VLP-Subtypen: einer enthielt Ovalbumin (OVA) auf der Oberfläche, der andere nicht. Den SPR-Sensor funktionalisierten die Forscher bei diesen Versuchen mit anti-OVA-Antikörpern. Hierbei applizierten sie zunächst HIV-VLPs mit OVA, und nach einem Waschschritt, HIV-VLPs ohne OVA. Auch diesen Test bestand das SPRI-System mit Bravour: SPR-Signale, die von HIV-VLPs mit OVAs ausgingen, waren 44-mal häufiger als Signale die von VLPs ohne OVA stammten.
Die SPR-Nanoskopie könnte also demnächst als schnelles, effizientes Verfahren zur Charakterisierung und Quantifizierung kleiner, biologischer Partikel, insbesondere Viren, in biowissenschaftlichen Laboren Einzug halten. Mit Diodenlasern als Lichtquelle, anstelle der bisher eingesetzten superlumineszenten Dioden, lässt sich möglicherweise auch die Sensitivität noch weiter steigern.
Und selbst wenn noch Fragen offen bleiben, etwa zum Einfluss der Partikelform auf die Detektion oder zum Mechanismus der Selektivität, so sind mit etwas Phantasie weitere Einsatzfelder der SPR-Nanoskopie denkbar. Neben dem Virennachweis wären dies zum Beispiel die Identifizierung extrazellulärer Vesikel sowie Konzentrationsmessungen von Drug Delivery Systemen oder Liposomen.