Die Wissenschaftsgemeinde diskutiert schon lange über Qualitätsstandards für Antikörper. Konkrete Vorgaben zur Antikörpervalidierung hat jetzt die International Working Group for Antibody Validation (IWGAV) ausgearbeitet.
Antikörper gehören zu den wichtigsten Werkzeugen von Biowissenschaftlern. Vor ihrem Einsatz sollte man sie jedoch auf Herz und Nieren prüfen.
Antikörper erkennen spezifische Motive (Epitope) ihrer Zielproteine. Ob und wie stark sie hieran binden und welche möglichen anderen Proteine sie ungewollt erkennen (Off-targets), hängt von vielen Faktoren, vor allem aber vom jeweiligen Einsatz ab. Beim Immunoblotting, der mit Abstand am häufigsten verwendeten Antikörper-basierten Methode, liegen Proteine hauptsächlich in denaturierter Form vor. Immunohistochemische und -cytochemische Experimente oder ELISA dagegen untersuchen native Proteine. Ein Antikörper, der Protein X im Immunoblot erkennt, kann unter Umständen für natives Protein X völlig blind sein.
Auch spielt es eine Rolle, wie hoch der Anteil von X in einem Proteingemisch ist. Je geringer, umso höher der Einfluss von Off-targets, also unspezifisch gebundener Proteine. Letztere können in der Summe beachtliche unspezifische (und somit irreführende) Signale liefern, selbst wenn die Affinität eines Antikörpers für Protein X viel höher ist als für ein anderes Protein.
Diesen Effekt sieht man zum Beispiel bei Immunoblots mit Blattmaterialproben. Viele Antikörper binden, wenn auch nur schwach, an das Chloroplasten-Protein RuBisCo (Ribulosebisphosphatcarboxylase). Es kommt in so großen Mengen vor, dass in der Summe ein beachtliches (unspezifisches) Signal resultiert. Haben Zielprotein X und Off-target das gleiche Molekulargewicht, liegen spezifisches und unspezifisches Signal übereinander. Die Aussagekraft eines Experiments steht und fällt deshalb mit der Qualität sowie Spezifität von Antikörpern – und natürlich auch mit den richtigen Kontrollen.
Die von elf internationalen Wissenschaftlern unter Vorsitz von Mathias Uhlén (siehe auch das Interview auf Seite 72) gegründete IWGAV-Gruppe schlägt deshalb fünf Eckpunkte (Conceptual pillars) vor, mit der Forscher die Qualität und Spezifität von Antikörpern überprüfen sollten (Nature Methods, 2016, doi: 10.1038). Autoren müssten, so die Forderung der IWGAV, in ihren Publikationen nachweisen, dass die eingesetzten Antikörper zumindest einen dieser Tests bestanden haben.
Als ersten Eckpunkt der Antikörpervalidierung empfiehlt die Gruppe eine simple genetische Strategie: ein Antikörper, der für Protein X spezifisch ist, liefert in Proben, die X nicht exprimieren, kein Signal. Als Kontrolle sollten deshalb Proben von Mutanten oder genetisch veränderten Organismen dienen, in denen X ausgeschaltet oder reprimiert ist.
Eckpfeiler Nummer zwei ist das Durchführen orthogonaler Experimente: parallel zur immunologischen Analyse bestimmt man das Protein X mit einer unabhängigen Methode, etwa der Massenspektrometrie (MS). Korrelieren die MS-Daten (relative Menge von Peptiden, die sich Protein X zuordnen lassen) mit denen des Immunoblots (relative Signalstärke in den einzelnen Proben), so gilt der Antikörper als validiert.
Die dritte Stütze der Antikörpervalidierung ist der Vergleich mit einem unabhängigen Antikörper. Diese Strategie setzt voraus, dass es bereits einen verifizierten Antikörper gegen Protein X gibt. Immunologische Experimente mit dem neuen, zu validierenden Antikörper, sollten zu gleichen Ergebnissen führen. Beispielsweise testet man dieselben Proben auf zwei parallelen Immunoblots, die man dann mit dem alten beziehungsweise neuen Antikörper hybridisiert.
Warum braucht man überhaupt einen „neuen“ Antikörper, wenn es schon einen etablierten gibt? Der „alte“ kann fast aufgebraucht sein oder der „neue“ soll ein anderes Epitop im selben Protein erkennen.
Als vierten Eckpfeiler zur Kontrolle von Antikörpern empfiehlt die IWGAV-Gruppe Fusionsproteine mit Peptid-Tags. Ist Protein X mit einem herkömmlichen „Tag“ fusioniert, zum Beispiel einem myc- oder poly-Histidin-Peptid, schlägt sie, analog zum Antikörpervergleich, parallele Tests mit anti-myc, anti-poly-His, etc. und dem zu validierenden Antikörper vor.
Der fünfte und letzte Stützpfeiler ist schließlich die Immunopräzipitation und MS. Bei der Immunopräzipitation dienen immobilisierte Antikörper der Anreicherung beziehungsweise Isolierung eines Zielproteins aus komplexen nativen Proteinextrakten. Interaktionspartner werden dabei automatisch mitisoliert und können mit Hilfe der MS identifiziert werden. Nach den Qualitätskriterien der IWGAV-Gruppe sollten die drei häufigsten MS-Peptide hierbei vom Zielprotein stammen.
Die Reproduzierbarkeit und Vollständigkeit veröffentlichter Daten ist essentiell, um darauf aufbauende Experimente vernünftig planen und mögliche Hindernisse abschätzen zu können. Deshalb sollen Forscher in Publikationen bei Immunoblot-Analysen zukünftig den gesamten Blot zeigen, nicht nur einen Ausschnitt. Zudem müssen sie alle unspezifischen Banden, egal welchen Molekulargewichts, dokumentieren (auch Schönheitsfehler außerhalb der bisher relevanten Blot-Region).
Zudem schlägt die IWGAV vor, im Methodenteil alle verwendeten Reagenzien akribisch aufzulisten. Aus „… was hybridised with anti-X antibody“ würde dann „The PVDF membrane (company xyz) was hybridised for 1 hour, at 22°C, with anti-X antibody (charge#, lot#, company), diluted 1:5,000 in TBST/5% milk ...”
Das ist sicherlich sinnvoll, doch wie werden die Journals mit den hierdurch automatisch steigenden Bildgrößen und Zeichenzahlen umgehen?
Zum Glück liegt die Beweispflicht aber nicht nur bei den Anwendern, sondern auch bei den Herstellerfirmen. Bevor ein Antikörper überhaupt in den Handel kommt, muss er den oben genannten Validierungsprozess erfolgreich durchlaufen. Für manche Firmen mag das bereits Standard sein, andere werden vermutlich mit Preiserhöhungen reagieren.
Schon seit einigen Jahren geben manche Firmen Gratisexemplare ihrer neuentwickelten Antikörper ab. Und sie erwarten dafür auch eine kleine Gegenleistung, in Form der Dokumentation entsprechender Experimente. Welches biologische Material wurde verwendet, wie war die Verdünnung des Antikörpers, etc?
Ist der Forscher mit dem Antikörper zufrieden und sein Blot oder seine ELISA-Grafik sind herzeigbar, haben beide Seiten gewonnen. Unter Umständen profitieren von diesen Aktionen auch andere Forscher, denn die Daten erscheinen teilweise auf den Webseiten der Firmen, meist mit dem Vermerk „In courtesy of ...“
Warum also den entsprechenden Kollegen nicht einfach anrufen oder eine Email-Anfrage senden? Eine zusätzliche objektive Meinung zu einem Antikörper kann nie schaden. Vielleicht ist dies jedoch bald nicht mehr nötig, wenn sich alle Herstellerfirmen an die Vorschläge der IWGAV-Gruppe halten.
Das elfköpfige Autorenteam stammt aus neun Forschungseinrichtungen, quer über den Globus verteilt: Schweden, USA, Kanada, Deutschland, Japan… Viele von ihnen sind auf die eine oder andere Weise mit Firmen verbandelt, die Antikörper herstellen oder vertreiben: Sie halten Beteiligungsrechte, sind (Mit)begründer, Berater oder Honorarempfänger. Da jedoch eine Vielzahl internationaler, voneinander unabhängiger Firmen (mehr als 20) vertreten sind, dürfte dies unproblematisch sein.
Bisher haben die Vorschläge der IWGAV beachtliches Interesse gefunden, Stand Mitte September gab es bereits 1543 „Views“ auf der Webseite von Nature Methods sowie 55 Tweets. Bei letzteren waren fast alle Firmen vertreten , mit denen die Autoren assoziiert sind – was nicht verwundert.
Die Antikörpervalidierung ist ein zeitlos-hippes Thema, das natürlich auch in Laborjournal immer wieder auftaucht. Aber vielleicht müssen wir dank der Vorschläge der IWGAV bald keine Wehklagen mehr über Antikörper hören, wie etwa in einem früheren „Neulich an der Bench“-Artikel (LJ 2014), in dem der Autor feststellte: „Viele kommerzielle Antikörper binden an alles, nur nicht an die Protein-Epitope, die sie eigentlich erkennen sollten.“
Und vielleicht entstehen durch den IWGAV-Appell sogar neue Start-ups. Könnten nicht Antikörperfirmen die Validierung „outsorcen“ und Werkaufträge an unterfinanzierte, Drittmittel-abhängige Forscher vergeben, die vorher einen entsprechenden „Eignungstest“ bestanden haben? Verblüfft hat mich, dass bei einem der „Muster“-Experimente in dem IWGAV-Paper offenbar eine Kontrolle fehlt. Ein spitzfindiger Referee hätte das nicht durchgehen lassen.
Abbildung 1d zeigt zwei Immunoblots. Für diese wurden Proteinextrakte aus IL-8-exprimierenden Zelllinien mittels SDS-PAGE aufgetrennt und geblottet. IL-8 trägt einen Peptid-Tag. Einen Streifen des in Duplikaten hergestellten Blots hybridisierten die Autoren mit einem anti-IL-8-Antikörper. Den anderen mit einem etablierten Antikörper, der gegen den Tag gerichtet ist.
Beide Blots liefern das gleiche Ergebnis: eine Proteinbande mit nicht angegebenem, aber gleichem Molekulargewicht. Das führen die Autoren als Beleg dafür an, dass der neue anti-IL-8-Antikörper funktioniert und spezifisch ist. Einspruch! Es ist nicht auszuschließen, dass der sekundäre Antikörper, ohne primären Antikörper als Brücke, an IL-8 oder ein co-migrierendes Protein bindet. Absolute Gewissheit bringt erst ein Blot ohne Primär-Antikörper.
Aus eigener Erfahrung mit Pflanzenextrakten möchte ich noch auf eine weitere Tücke beim Umgang mit Antikörpern hinweisen. Wer mit sekundären Peroxidase-gekoppelten Antikörpern arbeitet sollte sogar einen Kontroll-Blot gänzlich ohne Antikörper durchführen. Der Grund ist simpel: Proteinextrakte enthalten mitunter beachtliche Mengen an Peroxidasen. Diese werden zwar durch SDS und Erhitzen der Probe denaturiert, beim Inkubieren des Blots in TBS, PBS etc. jedoch wieder teilweise renaturiert. Da Peroxidasen generell nicht-wählerische und tüchtige Enzyme sind, reicht dies manchmal aus, die Substratlösung (Wasserstoffperoxid/Luminol) umzusetzen. Mit dem Ergebnis, dass auf dem Blot Banden auftauchen, die dem Experimentator die Bindung eines Antikörpers vorgaukeln.
Diese Falle hat jedoch auch eine positive Seite: Die Banden geben eine erste Auskunft über die Vielfalt und molekulare Größe der Peroxidasen im Ausgangsmaterial.