Ein elektrisches Feld versetzt Proteinkristalle in Bewegung, ein Röntgenstrahl „filmt” sie dabei – das Ganz nennt sich dann EF-X.
Wenn Biologen die molekulare Struktur eines Proteins kennen, haben sie einen entscheidenden Schritt auf dem Weg geschafft, die Funktion des Proteins im Detail zu verstehent. Sie wissen aber noch nicht, wie die intra- und intermolekularen Bewegungen innerhalb des Proteins oder Proteinkomplexes ablaufen.
Die Gruppe des amerikanischen Strukturbiologen Rama Ranganathan entwickelte eine neue Methode namens Electric Field-stimulated X-ray Crystallography (EF-X), mit der man diese Konformationsänderungen von Proteinen tatsächlich beobachten kann.
Mit Hilfe eines elektrischen Feldes erzeugt man bei der EF-X-Analyse Bewegungen innerhalb eines Proteinkristalls. Gleichzeitig bestrahlt man den Kristall mit schnellen Röntgenpulsen, um die Bewegungen räumlich und zeitlich mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse auflösen zu können.
Mit EF-X können Forscher Proteinbewegungen untersuchen, die für die biologische Funktion der untersuchten Proteine relevant sind. Zukünftig könnte diese Technik sogar den Weg zur vollständigen Beschreibung von Proteinmechaniken ebnen.
Das Prinzip der Methode ist erstaunlich simpel: Proteine enthalten viele elementare Ladungen und lokale Dipole. Mit einem starken elektrischen Feld, das auf die Proteinladungen einwirkt, induziert Ranganathans Team Bewegungen der Atome, die letztlich die Proteinstruktur beeinflussen.
Das neue Verfahren eliminiert einige Schwächen bisher verwendeter Techniken, etwa der NMR-Spektroskopie oder der Kristallographie. Diese liefern zum Beispiel keine ausreichenden Informationen zur zeitlichen Abhängigkeit der Konformationsübergänge. Auch sind zusammenhängende Bewegungen des Proteins (Collective Motions) mit diesen Methoden nicht zu erkennen. Hinzu kommt, dass die Zuordnung der gemessenen Parameter zur tatsächlich wirkenden physikalischen Kraft fehlt.
Selbst die zeitaufgelöste Kristallographie (TRX), die Proteinbewegungen zeitlich und räumlich exakt auflöst, ist hier überfordert. Sie funktioniert nur, wenn Licht Bewegungen (über Chromophore) innerhalb eines Proteins induziert. Die Lichtanregung ist jedoch lokal begrenzt und lässt sich nicht regulieren. Zudem liefert sie Energiemengen, die weit über denen liegen, die typischerweise für Konformationsübergänge nötig sind.
Selbstgebastelte EF-X-Apparatur: Der Proteinkristall ist zwischen unterer und oberer Elektrode montiert. Spannungspulse, die von der oberen Elektrode über den Kristall in die untere Elektrode fließen, erzeugen ein starkes elektrisches Feld innerhalb des Kristalls. Die Röntgenstrahlen werden von einem Kollimator fokussiert (waagrechter Stift) und treffen senkrecht zur Elektrodenachse auf den Proteinkristall. Foto: Gruppe Ranganathan
Mit der EF-X ist es dagegen möglich, die Stärke, Richtung und Dauer der auf das Protein einwirkenden Kraft zu steuern. Das elektrische Feld wirkt auf exakt bestimmbare Proteinladungen ein, die sich gleichmäßig über das Protein verteilen. Mit den gleichzeitig auf das Protein abgefeuerten schnellen Röntgenpulsen lassen sich die von dem elektrischen Feld ausgelösten Konformationsänderungen räumlich und zeitlich exakt auflösen.
Als Modellprotein für den Testlauf der EF-X-Methode wählten die amerikanischen Forscher die zweite PDZ-Domäne der humanen E3 Ubiquitinligase LNX2 (LNX2PDZ2). Ranganathans Mitarbeiter fixierten den LNX2PDZ2-Kristall über der Öffnung einer Glaskapillare, die eine Kristallisationslösung sowie eine Metallelektrode enthielt und als Bodenelektrode diente. Über dem Kristall platzierten sie eine zweite, ebenfalls mit Kristallisationslösung gefüllte Elektrode (Top-Elektrode), die über ein kurzes Verbindungsstück aus Kristallisationslösung mit der Bodenelektrode verbunden war. Den im Zwischenraum der beiden Elektroden liegenden Proteinkristall dichteten die Forscher an der Seite mit einem elektrisch isolierenden Klebstoff ab. Die Röntgenstrahlen leiteten die Amerikaner im rechten Winkel zur Achse der Elektroden durch den Kristall.
Die Forscher jagten kurze Spannungspulse durch den fünfzig bis hundert Mikrometer dicken Proteinkristall, woraus Feldstärken von 0,5 bis 1 Megavolt pro Zentimeter resultierten. Gleichzeitig bestrahlten sie ihn mit einzelnen, 100 Picosekunden schnellen Röntgenpulsen. Auf diese Weise bestimmten sie die Atomstruktur als Referenz vor dem elektrischen Puls, sowie zu jedem gewünschten Zeitpunkt nach dem elektrischen Puls.
Um die gewonnenen Datensätze analysieren zu können, mussten Ranganathans Leute wissen, wie das elektrische Feld die Symmetrie des Kristallgitters beeinflusst. Ein Kristallgitter besteht aus sogenannten Einheitszellen, die die Struktur des Gitters festlegen. Eine Einheitszelle lässt sich wiederum anhand von Symmetrieoperationen wie der Translation und der Rotation beschreiben. Beispielsweise haben LNX2PDZ2-Kristalle zusätzlich zur Translationssymmetrie zwei Rotationssymmetrien. Daraus ergeben sich vier symmetrische LNX2PDZ2-Monomere pro Einheitszelle.
Wird ein elektrisches Feld angelegt, so durchlaufen Proteinmoleküle mit unterschiedlichen Orientierungen im Kristallgitter verschiedene Veränderungen relativ zum elektrischen Feld: Sie sind also nicht mehr symmetrisch. Für den LNX2PDZ2-Kristall bedeutet dies, dass die vier Monomere einer Einheitszelle nicht länger identisch sind. Zwei Monomere zeigen in eine Richtung, die beiden anderen in die entgegengesetzte. Das elektrische Feld bricht also die Symmetrie innerhalb des Proteinkristalls.
Hierdurch konnten die Forscher Monomere mit unterschiedlicher Orientierung innerhalb der Einheitszelle vergleichen und so die Wirkung des elektrischen Feldes auf die einzelnen Atome analysieren. Zudem ist es möglich, durch das elektrische Feld physikalische Interaktionen innerhalb der Proteinstruktur zu beeinflussen und angeregte Zustände des Proteins zu modellieren.
Die EF-X-Analyse löst einerseits Konformationen auf, die energetisch nahe am Grundzustand liegen. Mit ihr lassen sich aber auch Strukturen herstellen, die einem angeregten Zustand entsprechen. Nimmt man die EF-X-Datensätze zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Start des elektrischen Feldpulses auf, so werden die Proteinbewegungen sichtbar und lassen sich in einem Video zusammenfassen, das den zeitlichen Ablauf der Proteinbewegungen zeigt.
Das amerikanische Forscherteam wollte jedoch auch wissen, ob die durch das elektrische Feld induzierten Bewegungen überhaupt etwas mit der biologischen Funktion des Proteins zu tun haben. Hierzu verglichen sie Konformationsänderungen in einer Region des Proteins die durch das elektrische Feld ausgelöst wurden, mit Änderungen, die von der Bindung eines Liganden herrührten.
Tatsächlich tauchten die Konformationsänderungen in beiden Fällen in vergleichbaren Proteinregionen auf. Dies ist insofern erstaunlich, da die Bindung eines Liganden und ein elektrisches Feld theoretisch völlig unterschiedliche Kräfte in einer Proteinstruktur auslösen sollten. Es bedeutet aber auch, dass die EF-X-Technik Bewegungen der Proteinstruktur erfasst, die biologisch relevanten mechanischen Mustern entsprechen.
Ganz ohne Schwächen ist aber auch die EF-X-Methode nicht: Die Handhabung des Proteinkristalls ist noch zu umständlich und auch die Elektroden sind ziemlich improvisiert. Bei der Daten- sowie Strukturanalyse sieht die Gruppe ebenfalls noch deutliches Verbesserungspotenzial.
Ein Ziel von Ranganathans Gruppe ist es, Proteine mit komplexeren Konformationsänderungen und sogar die Strukturen von Membranproteinen bei physiologisch relevanten elektrischen Feldern, mittels EF-X zu untersuchen. Dazu will die Gruppe die EF-X auch mit der Kraftspektroskopie kombinieren.
Die EF-X-Technik könnte sich also zu einem ziemlich spannenden Verfahren zur Bestimmung von Proteinmechaniken weiterentwickeln.