Foto: Jewish General Hospital
Noch sind bildgebende Durchflusszytometer ein seltener Anblick in biowissenschaftlichen Standardlaboren. Forscher am Leibniz-Institut für Photonische Technologien in Jena wollen dies ändern.
Partikel und Biopartikel begegnen uns nahezu überall im täglichen Leben: In Zellen, pflanzlichen Keimzellen und Pollenpartikeln, Krankheitserregern, Allergenen, Zusatzstoffen, Trägermaterialien oder sensorisch aktiven Transducermaterialien in modernen Lichtquellen und Sensoren.
Um diese Partikel und Partikelpopulationen charakterisieren zu können, benötigen Forscher hochdurchsatzfähige, bildbasierte Werkzeuge mit einer möglichst hohen Auflösung, welche die morphologischen und funktionellen Details erfassen.
Meist geschieht dies mit der konventionellen Durchflusszytometrie, die sich als Goldstandard für die Hochdurchsatz-Analyse von Partikeln, wie zum Beispiel Zellen, etabliert hat. Die Zählraten von Durchflusszytometern liegen bei mehreren tausend bis zu hunderttausend Partikeln pro Sekunde. Als Messkriterium verwendet man das von der Probe emittierte oder gestreute Summensignal der unterschiedlichen optischen Eigenschaften (Lichtstreuung, Fluoreszenz und Absorption). Das Signal ermöglicht die Klassifizierung der Partikel und die statistische Analyse der Population.
Die Anzahl der für die Klassifizierung nutzbaren Eigenschaften ist hierbei identisch mit der Zahl der verwendeten Detektionskanäle. Schnell auslesbare Einzeldetektoren (Fotomultiplier, Avalanch Fotodioden) in den Instrumenten erlauben hohe Datenraten und Durchsätze. Die nötige Flexibilität für die Ausleseparameter liefern vorgeschaltete Markierungstechniken wie zum Beispiel Immunfärbung, Farbstoffmarkierung oder Nanopartikelmarkierung. Mit diesen Verfahren können bestimmte Zieleigenschaften der Zellen selektiert und auf der Ebene von Einzelzellen quantifiziert werden.
Morphologische Details lassen sich mit diesem messtechnischen Ansatz jedoch nicht auflösen und werden hierdurch nicht berücksichtigt.
Diese Einschränkung überwindet die bildgebende Durchflusszytometrie, bei der das Gerät für jeden Partikel und jeden Farbkanal ein Messbild erfasst und auswertet.
Die derzeitig erhältlichen kommerziellen Systeme erzielen Bild-Raten von mehr als zehntausend Zellen pro Sekunde in bis zu zwölf Farbkanälen (Hellfeld und Fluoreszenz). Bislang sind diese Instrumente jedoch nur in wenigen Forschungszentren und Service-Einrichtungen installiert. Um die bildgebende Durchflusszytometrie als Standard-Laborverfahren zu etablieren, müssen etliche technologische Herausforderungen überwunden werden.
Ein wesentlicher Nachteil der Mikroskopie als abbildendes Verfahren ist ihre geringe Tiefenschärfe. Je nach Vergrößerung und numerischer Apertur des verwendeten Objektivs, liegt diese zwischen 0.5 und 5 Mikrometer. Messbilder lassen sich jedoch nur vergleichen, wenn alle untersuchten Partikel innerhalb der Tiefenschärfe-Ebene abgebildet werden. In der konventionellen Mikroskopie mit ortsfesten Objekten erreicht man dies durch die Nachführung der Fokusposition am Z-Trieb des Mikroskops.
Der Jenaer Mikrofluidik-Chip fokussiert die Partikel in drei Stufen. In der ersten presst er sie zu einer senkrecht stehenden Scheibe zusammen (First Flow Focusing, FFU1). Anschließend kippt er die Partikel-Scheibe von der Senkrechten in die Horizontale (Fluid Rotation Unit, FRU). Im letzten Schritt lenkt er schließlich wandnahe Partikel näher zum Zentrum des Kanals (FFU2). Das hieraus resultierende zweidimensionale Partikelfeld fließt in der Bildebene durch die Messzelle und wird von der Optik des Systems erfasst. Foto: Thomas Henkel
Für die bildgestützte Durchflusszytometrie bedeutet dies, dass alle Partikel den Messkanal innerhalb des Tiefenschärfebereiches des abbildenden Systems durchlaufen müssen. Ihre exakte Führung und automatische Ausrichtung (Alignment) in der Ebene der Tiefenschärfe erzielt man durch hydrodynamische Fokussierung mithilfe von Hüllströmungen.
Wie bei der konventionellen Durchflusszytometrie werden die Partikel mit horizontalen und vertikalen Hüllströmen in eine Vorzugsposition fokussiert. Anschließend durchlaufen sie das Zentrum der Messzelle im Gänsemarsch mit einer Geschwindigkeit von circa einem Meter pro Sekunde. Der schnelle Transport ist Voraussetzung für die hohen Messraten bei der konventionellen Durchflusszytometrie.
Analoge hydrodynamische Fokussierungs-Verfahren setzen die Geräteentwickler auch in der bildgestützten Durchflusszytometrie ein. Für die Erfassung der Messbilder ist eine Ortsauflösung von mindestens 1 Mikrometer nötig. Begrenzt wird die Auflösung durch die verwendeten Objektive sowie die Bewegungsunschärfe. Letztere resultiert aus dem Produkt der Partikelgeschwindigkeit und der Expositionszeit.
Bildgebende Durchflusszytometrie von Vollblut-Proben. Foto: Thomas Henkel
Bereits bei einer Transportgeschwindigkeit von nur 1 Millimeter pro Sekunde und einer Expositionszeit von 1 Millisekunde beträgt die Bewegungsunschärfe 1 Mikrometer. Typische Expositionszeiten in der Fluoreszenzmikroskopie liegen bei 100 Millisekunden bis zu mehreren Sekunden.
Diese hohen Anforderungen an die Sensitivität des optischen Systems erklären den häufig geringen Durchsatz der bildgestützten Durchflusszytometrie. Leistungsfähige Lichtquellen und spezielle Algorithmen (Time Delay and Integration) der Messbilderfassung gleichen dies in kommerziellen Systemen aus. Eine Alternative zur Fokussierung der Partikel als Linie (ImageStream) ist die Fokussierung in einer Ebene und die parallele Aufnahme eines zweidimensionalen Partikelfeldes. Ein einziges Messbild erfasst hierdurch bis zu 300 Blutzellen bei einer Transportgeschwindigkeit von 1 Millimeter pro Sekunde. Sowohl für Fluoreszenz- als auch Hellfeld-Messbilder genügen hierbei Standard-Kameras und Expositionszeiten von 1 Millisekunde. Auf spezielle Akkumulationstechniken für bewegte Objekte kann man bei diesem effizienten und kostengünstigen Ansatz verzichten.
Auf dem Mikrofluidik-Chip fokussierte Mikroalgen. Foto: Thomas Henkel
Kernstück der am Leibniz Institut für Photonische Technologien (IPHT) in Jena entwickelten Systemlösung für die bildgestützte Durchflusszytometrie sind mikrofluidische Chipsysteme mit einer integrierten dreidimensionalen Fokussierung der Partikel in der Fokusebene des abbildenden Systems.
Im Gegensatz zu klassischen Konstruktionen durchströmen die Partikel den Detektionsabschnitt als zweidimensionales Partikel-Feld innerhalb der Bildebene des Systems. Die Fokussierung erfolgt Schrittweise im mikrofluidischen Bauelement.
Im ersten Schritt wird die Partikelströmung zu einer vertikal stehenden Lamelle komprimiert. Dies geschieht durch seitlich in ein Kanalkreuz einlaufende Hilfsfluide. Nachfolgend wird die senkrechte Lamelle durch Rotation um 90 Grad relativ zur Transportrichtung in eine horizonale Lamelle überführt. Im letzten Schritt werden durch seitliche Hilfsströmungen Partikel aus wandnahen Zonen in Richtung Kanalmitte ausgelenkt, so dass alle Partikel die Messzelle im festgelegten Ausschnitt des Detektionsfensters durchlaufen.