Hydrogele eignen sich für die 3D-Zellkultur und könnten auch bald in der Klinik öfter zum Einsatz kommen. Seit knapp zehn Jahren steigt das Interesse an dem Polymer-basierten Material zunehmend. Laborjournal hat sich mit vier Forschern unterhalten, um mehr über die neue Allzweck-Waffe zuerfahren.
Zellen reagieren auf ihre Umgebung. Dabei spielen sowohl mechanische als auch chemische Eigenschaften eine große Rolle. So beeinflusst beispielsweise die Festigkeit des umliegenden Gewebes, aber auch die Zusammensetzung von Adhäsionsliganden oder Wachstumsfaktoren, wie Zellen proliferieren, migrieren, differenzieren und sich anheften. Das wissen Zellbiologen und Biophysiker schon eine Weile – und erhalten bei ihren Studien immer häufiger die Unterstützung von Materialwissenschaftlern. Denn um das Verhalten der Zellen auf ihre Umgebung zu untersuchen, muss die Zellnachbarschaft möglichst naturgetreu nachgebaut werden.
Ein Material eignet sich dafür besonders: Hydrogele. Ihr Grundgerüst ist ein Polymer, das zwar wasserunlöslich ist, aber dennoch viel Flüssigkeit aufnehmen kann. Hydrogele bestehen deshalb zu achtzig bis neunzig Prozent aus Wasser, wodurch sich das synthetische Material besonders in der Zellkultur als durchaus nützlich erweist.
Das weiß auch Christine Selhuber-Unkel von der Christian-Albrechts-Universität (CAU) zu Kiel. „Das Problem bei der gängigen 2D-Zellkultur ist, dass die Zellen maximal fünfzig Prozent der umliegenden Oberfläche berühren“, so die Leiterin der Arbeitsgruppe „Biokompatible Nanomaterialien“. Mit ihrem neuen Projekt „Channelmat“ – von Channel und Material – möchte Selhuber-Unkel die Kontaktfläche auf bis zu achtzig Prozent erhöhen, denn: „Mehr Kontakt bedeutet mehr Kontrolle.“ Funktionieren soll das durch ein 3D-Hydrogel aus Polyacrylamid, in dessen Innerem Kanäle integriert sind und das damit die extrazelluläre Matrix ideal nachahmen soll.
Um die Kanäle herzustellen, verwenden die Kieler Forscher ein Templat aus der benachbarten Arbeitsgruppe um Rainer Adelung, über welches sie das Hydrogel gießen. Sobald das Gel durch Vernetzung ausgehärtet ist, waschen Selhuber-Unkel und Co. das Templat mit einer schwachen Säure wieder heraus. Zurück bleibt ein circa ein Zentimeter dickes Hydrogel mit einem relativ ungeordneten Kanalsystem, dessen Kanäle jedoch miteinander verbunden sind. „Die meisten Hydrogele verfügen nur über kugelförmige Poren, die erst ab einer gewissen Porendichte miteinander verknüpft sind“, berichtet Selhuber-Unkel und ergänzt stolz: „Im Channelmat hingegen gibt es wirklich zylinderförmige Kanäle, die aufgrund der Herstellungsmethode immer verbunden sind.“
Ein weiteres Highlight ist der Durchmesser der Kanäle. Die Template bestehen aus einem vierarmigen Gebilde, welches in der Mitte zusammenläuft. Die Armdicke und damit auch den Kanaldurchmesser können die Materialwissenschaftler zwischen wenigen Nanometern und Mikrometern einstellen – theoretisch. „In der Praxis können wir bisher Kanäle mit einem Durchmesser von einem bis zu zwanzig Mikrometern produzieren“, meint Selhuber-Unkel. Und das ziemlich schnell: Bis zu einhundert Proben kann das Forscherteam am Tag problemlos herstellen. „Das muss ein 3D-Drucker erstmal schaffen“, so die Kielerin.
Der schnelle Herstellungsprozess macht das Hydrogel natürlich auch für die Industrie interessant. Deshalb lautet der Plan von Selhuber-Unkel et al. für die Zukunft: Industriepartner finden, die Channelmat zur Marktreife bringen möchten. Ein Patent für das Material hat Selhuber-Unkel bereits angemeldet.
Doch bevor die Vermarktung im industriellen Maßstab erfolgen kann, benötigen die Kieler ein Proof-of-Concept. Dabei hilft ihnen der Europäische Forschungsrat, der gerade eine Förderung von 150.000 Euro an das Projekt vergeben hat.
Ein weiteres Ziel für die Zukunft ist, das Material abbaubar zu machen. Denn aktuell schaffen es die Zellen noch nicht, das Hydrogel zu zersetzen. Doch nur ein abbaubares Material kann neben der Zellkultur auch als Implantat in der regenerativen Medizin zum Einsatz kommen. Dort können Hydrogele beispielsweise bei einem Herzinfarkt helfen, abgestorbenes Gewebe zu regenerieren – vorausgesetzt, die Kieler entscheiden sich für ein anderes Polymer. Denn Polyacrylamid ist für die Klinik weniger geeignet, da immer ein Restrisiko durch gegebenenfalls nicht polymerisierte, toxische Acrylamide besteht. „Momentan versuchen wir für klinische Anwendungen auf ein anderes Polymer umzusteigen – Poly-HEMA [Anm. d. Red. Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)] wäre eine Möglichkeit“, berichtet Selhuber-Unkel. Um die Lagerung und Kultivierung von Gewebezellen und Stammzellen in den neuen Materialien zu untersuchen, eignet sich Polyacrylamid als Modellsystem jedoch hervorragend.
In Sachen Abbaubarkeit der Hydrogele ist Britta Trappmann vom Max-Planck-Institut für molekulare Biomedizin in Münster schon einen Schritt weiter. Die Chemikerin entwickelt mit ihrem Team synthetische 3D-Hydrogele für die Grundlagenforschung. Die Gele sollen wie bei Selhuber-Unkel die extrazelluläre Matrix imitieren, damit Forscher das Verhalten der Zellen und ihre Wechselwirkungen mit dem umliegenden Gewebe besser studieren können. „Ziel ist es, alle Matrixparameter, welche die Zelle beeinflussen, zu verstehen“, greift Trappmann weit in die Zukunft vor.
Fibroblasten in einer nicht-abbaubaren (oben) und abbaubaren (unten) 3D-Hydrogel-Matrix. Fotos: MPI Münster/ Britta Trappmann
Die Münsteraner nutzen dabei zwei Eigenschaften der Hydrogele: Das Grundmaterial auf Polymerbasis selbst interagiert nicht mit den Zellen und ist äußerst variabel. So können Wissenschaftler die mechanischen Eigenschaften wie die Festigkeit des Gels zwar je nach Belieben einstellen, aber auch konstant replizieren. Andere Parameter, zum Beispiel Wachstumsfaktoren oder Anheftungsliganden, lassen sich wie bei einem Baukastenprinzip beliebig ergänzen und in einer ansonsten gleichbleibenden Umgebung ideal untersuchen.
Der Fokus der Gruppe liegt auf den mechanischen Eigenschaften der Matrix sowie ihrer Abbaubarkeit. Denn die löslichen, linearen Polymerketten werden auf unterschiedliche Art und Weise zu einem gelartigen Material vernetzt – das die Zelle zersetzen muss. „Damit die Zelle überhaupt in das Material eindringen kann, muss sie die Vernetzungen aufbrechen können“, erklärt Trappmann. Eine Möglichkeit, das Material abbaubar zu machen, beruht darin, spaltbare Peptidsequenzen zu integrieren. Diese können dann durch Enzyme verdaut werden, welche die Zelle freisetzt – durch sogenannte Matrix-Metalloproteasen.
Trappmann und Co. können allerdings auch nicht-abbaubare Peptidsequenzen einfügen und das Material dadurch resistenter gestalten. „Das ist von Vorteil, wenn man zum Beispiel mesenchymale Stammzellen in Fettzellen differenzieren möchte“, meint die Chemikerin. Denn in einer Zellkultur mit schlecht abbaubaren Hydrogelen können die Zellen nicht mehr so gut in das Material migrieren und bleiben rundlich. Die runde Zellform wiederum beeinflusst die Fett-Differenzierung positiv.
Auch bei der Angiogenese ist darauf zu achten, dass Zellen nicht zu leicht in die synthetische Matrix eindringen können.
Denn wenn die Zellen das Hydrogel zu schnell zersetzen, können sie nicht mehr kollektiv einwandern. In solch einem Fall brechen die Zellstrukturen auseinander, es dringen nur einzelne Zellen in das Gel ein und die Blutgefäßbildung ist gestört. „Allerdings beeinflussen nicht nur die Peptidsequenzen, wie schnell das Gel abgebaut wird“, so Trappmann. „Unterschiedliche Zelltypen können die Sequenzen unterschiedlich schnell spalten.“
Das von Trappmann et al. verwendete Material basiert auf dem Zuckermolekül Dextran und verfügt über funktionelle Gruppen (sogenannte Methacrylate), an die die Materialwissenschaftler Adhäsionsliganden koppeln können, die Integrine binden. Aber auch Wachstumsfaktoren können theoretisch in die synthetische Matrix eingebunden werden – was Trappmann und Co. in Zukunft praktisch umsetzen möchten. Denn in der klassischen Petrischalen-Zellkultur schwimmen die Faktoren im Gegensatz zur Situation im natürlichen Gewebe frei in Lösung und verhalten sich vielleicht ganz anders. „Es wurde schon gezeigt, dass die Anbindung der Wachstumsfaktoren an Matrizen oder Oberflächen deren Aktivität extrem verändert“, so Trappmann. Ob sich möglicherweise auch die mechanischen Eigenschaften des Hydrogels auf die Aktivität der integrierten Wachstumsfaktoren auswirken, wird sich dann zeigen.
Während sich die Hydrogele von Selhuber-Unkel und Trappmann vorerst auf die Zellkultur konzentrieren, plant Laura De Laporte vom Leibniz-Institut für Interaktive Materialien e.V. (DWI) in Aachen gezielter den Einsatz in der Klinik. Das von ihrem Team entworfene Hydrogel löst ein Problem der Hydrogele: Denn obwohl synthetische Hydrogel-Matrizen mit Poren oder Kanälen bereits schnell und effizient produziert werden können, sind die Kanalsysteme und das Material in der Regel ungeordnet und vor allem nicht ausgerichtet. „Das ist ein Problem, denn eigentlich sind sehr viele Gewebe im Körper orientiert“, erklärt De Laporte. „Zum Beispiel Zellen im Herzen und anderen Muskeln sowie Nervenzellen.“ Mit einem kleinen Trick haben es die Ingenieurin und ihr Team geschafft, dieses Problem zu umgehen – daraus entstanden ist das sogenannte Anisogel. Dieses Hydrogel besteht aus zwei Komponenten: einer Polymermatrix und ganz kleinen weichen Mikrogel-Stäbchen oder kurzen, steiferen Polymer-Fasern. Der Clou an der Sache: Die Stäbchen und Fasern enthalten winzige supermagnetische Eisenoxid-Nanopartikel, sodass sie sich beim Eintauchen in ein Magnetfeld in eine bestimmte Richtung ausrichten.
In der Praxis sähe das theoretisch wie folgt aus: Ein Arzt injiziert die Polymerlösung in das gewünschte Gewebe und legt zeitgleich ein magnetisches Feld an, welches die Stäbchen beziehungsweise Fasern direkt anordnet. Prompt vernetzt das Hydrogel – und die Stäbchen oder Fasern können sich nach etwa einer Minute nicht mehr vom Platz bewegen.
Das benötigte Magnetfeld bedarf keiner besonders großen Stärke, wie De Laporte ausführt: „Ein Magnet auf Ihrem Kühlschrank hat circa 15 Millitesla. Um die Stäbchen anzuordnen, reichen uns 80 Millitesla – ein aufwändiges MRA [Anm. d. Red. Magnetresonanzangiogramm] mit 1,5 Tesla oder mehr ist nicht nötig.“
Die Polymerketten in der injizierten Lösung vernetzen im Übrigen durch den Fibrin-stabilisierenden Faktor (Faktor XIII), ein Enzym, das als Gerinnungsfaktor auch für die Blutgerinnung zuständig ist. Das funktioniert deshalb, weil die Aachener das Anisogel mit Fibrin mischen – beziehungsweise gemischt haben: „Mittlerweile verwenden wir ein synthetisches Polymer, das die gleiche Vernetzungsstrategie verwendet wie Fibrin.“ Denn natürliche Materialien können im Körper problematisch werden. Entweder baut sie der Organismus zu schnell oder unkontrolliert ab, oder das Material kann im schlimmsten Fall pathogene Komponenten beinhalten. Mit synthetischen Polymeren können De Laporte und Co. diese Probleme leicht umgehen und gleichzeitig die mechanischen Eigenschaften und Abbaukinetiken besser steuern.
Ein weiterer Vorteil des Anisogels: Der Körper kann es abbauen. Als erstes zersetzen die Zellen die umgebende Polymer-Matrix, es entstehen Hohlräume – und die Zellen können in das Material einwachsen, während sie durch die orientierten Stäbchen oder Fasern in eine vorgegebene Richtung geführt werden. Die langlebigeren Stäbchen oder Fasern werden zwar später, aber genauso wie die Polymer-Matrix durch Hydrolyse abgebaut. Insgesamt sollte das Anisogel in Ratten circa fünf Wochen standhalten, bevor sich das Material komplett aufgelöst hat. Beim Menschen schätzt De Laporte die Abbaudauer auf mehrere Monate. „Das Gel darf natürlich nicht zu schnell verschwinden“, sagt die Ingenieurin. „Die Zellen müssen genug Zeit haben, in das Hydrogel einzudringen und sich zu regenerieren. Interessant ist, dass sich durch die ausgerichteten Zellen auch eine ausgerichtete extrazelluläre Matrix entwickelt, die dann die Aufgaben des sich abbauenden Hydrogels wieder übernehmen kann.“
Zu Beginn fokussierten sich die Aachener auf den zukünftigen Einsatz bei Rückenmarksverletzungen. Doch das Anisogel könnte sich auch bei Herzinfarkten als nützlich erweisen. Denn in der Theorie lässt sich das Anisogel leicht invasiv injizieren und sogar mit Zelltransplantaten oder Stammzellen mischen.
Christine Selhuber-Unkel (rechts) besiedelt mit zwei Mitarbeitern das neue Hydrogel mit Zellen. Fotos: CAU
Doch bis es so weit ist, müssen die Wissenschaftler rund um De Laporte noch ein wenig arbeiten. „Wir fangen dieses Jahr hoffentlich mit den Tierversuchen an Ratten an“, so De Laporte. „Die Anträge dafür sind schon eingereicht.“ Doch obwohl die Versuche mit primären Zellen vielversprechend waren, kann es in vivo bekanntlich ganz anders aussehen. Funktionieren die Tierversuche, geht es zur nächste Etappe: „Dann müssen wir jemanden finden, der das auch klinisch probieren möchte“, meint De Laporte. Glücklicherweise haben die Forscher schon ein Patent eingereicht. „Denn die Industrie ist nur an einem Produkt interessiert, das auch patentiert ist.“
Die Arbeitsgruppe „Dynamische Biogrenzflächen“ am Max-Planck-Institut für Polymerforschung in Mainz denkt derweil noch gar nicht an Patente. Sie möchte die Zellkultur für Stammzellen weiterentwickeln, sodass sich aus ihnen Neurone differenzieren. „Wir versuchen die Steifheit von Gehirngewebe mithilfe unserer Hydrogele nachzuahmen“, erklärt Marcelo Salierno, Postdoktorand in Mainz. Aber wie steif sind eigentlich unterschiedliche Gewebe im Körper? „Das Gehirn ist das weichste aller Gewebe im menschlichen Körper“, so Salierno. „Um dieses zu verformen, reicht der Druck von 0,1 bis 1 Kilopascal aus – Muskeln sind da schon viel härter: Sie verformen sich erst bei 10 bis 20 Kilopascal.“ Wie viel Druck ein Gewebe aushält und wie steif es dementsprechend ist, untersuchen die Biomaterialwissenschaftler mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM von Atomic Force Microscope).
Für die Herstellung des Hydrogels verwenden die Mainzer aktuell Polyacrylamid. „Auch Polyethylenglycol würde als Polymer funktionieren, aber wir haben uns für Polyacrylamid entschieden, weil es für die meisten Biologen ein vertrautes Material ist, mit welchem sie schon einmal gearbeitet haben“, erklärt Salierno.
Das Hydrogel alleine verhält sich zwar wie Gewebe, doch die Zellen können so noch recht wenig mit der synthetischen Matrix anfangen. Stichwort Anheftungsfaktoren. Salierno und Co. entschieden sich für eine Peptidsequenz aus Laminin – eines der häufigsten Proteine der Basallamina der extrazellulären Matrix vor allem bei Epithelzellen – genauso wie Polylysin. Letzteres kennen die meisten Biologen als Pufferzusatz für die Zellkultur. Laminin hingegen ist ein recht großes Glykoprotein, welches unterschiedliche Anheftungsseiten aufweist. Eine davon ist IKVAV. IKVAV ist ein Peptid aus fünf Aminosäuren, die ihm auch seinen Namen geben: Isoleucin(I)-Lysin(K)-Valin(V)-Alanin(A)-Valin(V) – IKVAV. Publikationen aus den Neunzigern zeigen, dass IKVAV die Ausbreitung von Neuronen stimuliert.
Interessanterweise schafften es weder das synthetische IKVAV noch Polylysin alleine, dass Zellen in vitro langfristig an das Hydrogel banden. Erst die Kombination der beiden Anheftungsfaktoren und die gehirnartige Weichheit des Polymers unterstützten die Neurogenese von Stammzellen.
In Zukunft möchten Salierno und Co. mit den Hydrogelen noch genauer herausfinden, wie die Umgebung das Schicksal von Stammzellen mitbestimmt. „Wir wissen, dass nicht nur die Genetik eine große Rolle spielt“, so Salierno. Laut dem Mainzer konzentrieren sich die Forscher bisher zu sehr auf die Genetik der Zellen und weniger auf die Umgebung, die allerdings einen wichtigen Part bei der Zellentwicklung einzunehmen scheint. „Zu Beginn können Stammzellen sich zu allen möglichen Zellen differenzieren – sie können quasi werden, was immer sie wollen. Was ihr Schicksal letztlich bestimmt, ist die Umgebung“, meint Salierno und zieht den Vergleich: „Es ist wie in unserer Gesellschaft. Es kommt natürlich auch darauf an, was jeder einzelne von uns mitbringt, aber unser Umfeld bestimmt doch stark, wo wir mal hinkommen.“