(11.11.2019) Früher war das Färben von DNA in Agarose-Gelen einfach: Es gab nur Ethidiumbromid und damit war die Sache erledigt. Heute hat man die Qual der Wahl und weiß oft nicht so recht, welchen Farbstoff man nehmen soll.
Seit Erfindung der DNA-Agarose-Gelelektrophorese in den späten sechziger Jahren des vorigen Jahrhunderts hat sich einiges getan. Die Apparaturen sind nicht nur deutlich schicker geworden: Sie sind auch einfacher zu bedienen und lassen Läufe unter höherer Spannung zu, ohne den Raum in Rauch zu hüllen. Und der früher regelmäßig in den Laboren zu hörende Ausruf: „Scheiße, mein Gel ist zu weit gelaufen“, gehört dank integrierter Stoppuhr und automatischer Abschaltung der Vergangenheit an.
Während die elektrophoretische Auftrennung der DNA in Agarose-Gelen weitgehend ausgereizt ist und sich kaum noch weiter optimieren lässt, ist bei der Visualisierung der getrennten DNA mit Farbstoffen noch einiges herauszuholen. Das gilt nicht nur für die eingesetzten Wellenlängen, sondern auch für alternative Farbstoffe, die das althergebrachte Ethidiumbromid (EtBr) ersetzen sollen.
Ob die DNA-Banden mit einem der neuen Farbstoffe besser aussehen würden? Foto: Protocol-Online
Das als mutagen sowie krebserregend geltende EtBr hält sich beharrlich in einigen Laboren, weil es als DNA-interkalierende Substanz nicht nur verlässlich und sensitiv ist, sondern auch super-billig. In den letzten Jahren kam jedoch eine bunte Palette neuer DNA-Farbstoffe auf den Markt. Und natürlich reklamiert jeder Hersteller für seinen Farbstoff, dass er bessere Banden liefert und ungiftig ist. Aber Vorsicht! Das Foto eines Agarose-Gels mit supersauberen Banden von DNA im Nanogrammbereich mag beeindrucken. Nur sollte man auch hinterfragen, ob der Farbstoff wirklich so ungiftig ist wie deklariert, und ob er das Laufverhalten der DNA-Moleküle nicht doch beeinflusst.
Prinzipiell kann man die DNA in Agarose-Gelen mit drei Techniken färben, die sich im Wesentlichen darin unterscheiden, wann der Farbstoff ins Spiel kommt: Man kann ihn direkt in den Ladepuffer mischen und zusammen mit der Probe in die Gelspur laden (Pre-Loading); bereits beim Gießen des Gels zusetzen (Pre-Casting); oder als verdünnte Farbstofflösung verwenden, um die DNA-Banden in dem gelaufenen Gel erst nach der Elektrophorese zu färben (Post-Staining). Alle drei Methoden sind gängige Praxis.
Aber welche ist die zweckmäßigste? Wie so oft im Labor lautet die Antwort: „Es kommt drauf an“. Zum Beispiel darauf, wie viel Budget oder Geduld man hat, wie sensitiv detektiert werden soll, ob eine Veränderung des Banden-Laufverhaltens stört oder nicht so kritisch ist, und ob es sich um eine präparative Gelelektrophorese handelt.
Generell ist das Post-Staining-Verfahren am sensitivsten. Außerdem kann hier die DNA ganz ungezwungen ihrer Größe und Ladung entsprechend im Gel wandern. Ist der Farbstoff dagegen bereits im Probenpuffer oder Gel gegenwärtig, kann dies das Laufverhalten ändern und auch zu einer hässlichen „Vorderfront-Wolke“ führen, in der sich der nichtgebundene Farbstoff anhäuft. Wer Fragmente im Visier hat, die aufgrund ihrer Länge eher hinter dieser Wolke unterwegs sind, ist mit dem Post-Staining meist besser beraten. Die halbe Stunde zusätzliche Wartezeit für das Färben und Waschen des Gels lässt sich mit Protokollschreiben oder Lektüre füllen. Beim Post-Staining geht aber mehr (teurer) Farbstoff drauf, denn das Gel taucht nun mal nur ab einem gewissen Pegelstand unter. Die Kosten relativieren sich jedoch, wenn man das Färbebad mehrfach nutzt.
Als direkte Zugabe zur Probe sind DNA-Farbstoffe am effizientesten: Der Verbrauch liegt nur bei einem Hundertstel des Pre-Casting-Verbrauchs. Diverse Firmen bieten fix-und-fertige Varianten an, die Ladepuffer und Farbstoff enthalten. Diese Bequemlichkeit lassen sie sich aber ordentlich bezahlen.
Andie Hall, Forschungsassistentin am Naturhistorischen Museum in London, wollte sich nicht mehr nur auf ältere Studien zu DNA-Farbstoffen verlassen, in denen die neuesten Farbstoffe nicht berücksichtigt wurden. Sie verglich deshalb die aktuell gebräuchlichen Gelfarbstoffe GelRed, GelGreen, SafeView, SYBR-Safe und EZ-VisionIn-Gel Solution sowie die Ready-Load-Farbstoffe SafeWhite und EZ-VisonOne miteinander (www.biorxiv.org/content/10.1101/568253v1). Die Farbstoffe testete sie in vier Färbemethoden: Pre-Loading, hundertfach Pre-Loading, Pre-Casting und Post-Staining. Als Test-DNA verwendete Hall verschiedene DNA-Marker sowie DNA-Fragmente bekannter Größe und Konzentration.
Die Pre-Loading-Rezepturen enthielten den Farbstoff in einfacher oder hundertfacher Konzentration in klassischem Ladepuffer mit 0,25 Prozent Bromphenolblau, 0,25 Prozent Xylencyanol und dreißig Prozent Glycerol. Für Pre-Cast-Färbungen gab Hall den Farbstoff in einer Verdünnung von eins zu zehntausend vor dem Gießen des Gels zu einer einprozentigen Agarose-Lösung. Das Post-Staining führte sie gemäß den Herstellerangaben mit Verdünnungen von eins zu dreitausend sowie eins zu viertausend in Wasser, Salz- oder Pufferlösung durch. Für die Fluoreszenz-Aufnahmen der gefärbten Gele verwendete Hall einen Alpha-Imager sowie einen UV-Transilluminator mit UV- oder SYBR-Filter. Für den Vergleichstest berücksichtigte sie nur die besten Fotos.
Hall stellte deutliche Unterschiede bei der Sensitivität der einzelnen Färbemethoden und Farbstoffe fest. Das Post-Staining-Verfahren war immer am sensitivsten, die Farbstoffe GelGreen und GelRed detektierten jeweils die kleinsten Mengen. Einige Farbstoffe sind für bestimmte Färbemethoden gänzlich ungeeignet und erkennen quasi nichts, etwa SafeView und SYBR-Safe beim Pre-Loading-Verfahren. Dafür brillieren sie aber manchmal bei anderen Färbetechniken, wie zum Beispiel SYBR-Safe beim Post-staining-Verfahren.
Die Kosten für ein fertig gefärbtes Gel variierten je nach Färbemethode um mehr als das Hundertfache. Die Preisunterschiede zwischen verschiedenen Farbstoffen waren bei weitem nicht so groß und lagen etwa bei einem Faktor zwei. Post-Staining war jeweils am teuersten, wenn das Färbebad nicht mehrfach verwendet wurde.
Einige Farbstoffe beeinflussten die Migration der DNA, wobei dies auch von der jeweiligen Färbemethode abhing. So führte zum Beispiel die Färbung mit GelGreen bei den Pre-Loading- und Pre-Casting-Verfahren zu einem inkonsistenten Laufverhalten der DNA. Nur bei dem Farbstoff EZ-Vision war die Laufstrecke der diversen Banden bei allen Färbeverfahren identisch.
Die Farbstoffkonzentration sollte man nicht nur aus Kostengründen niedrig halten: Bei höheren Konzentrationen verschmieren die Banden. Ob hinter diesen noch weitere Fragmente stecken, lässt sich dann unmöglich sagen. Insbesondere SYBR-Fans müssen noch eine zusätzliche Hürde überwinden, egal welche Methode sie verwenden: Einige Mikroorganismen sowie Kleidungsaufheller, die auch für das Waschen von Labormänteln eingesetzt werden, fluoreszieren genau im Wellenlängenbereich von SYBR und können das Gel-Foto versauen. Das Färbebad wiederzuverwenden ist deshalb beim Post-Staining-Verfahren nicht ratsam.
Halls Farbstoff-Favorit ist ein selbstgemixter Ladepuffer mit zehnfach konzentriertem GelRed. Wenn sie die Länge der DNA-Fragmente akkurat ermitteln will, setzt sie auf das Post-Staining-Verfahren mit einem EZ-Vision-Färbebad, das sie möglichst oft wiederverwendet.
Mitarbeiter der kalifornischen Firma Biotium, die sich ganz dem Farbstoffgeschäft verschrieben hat, nahmen ebenfalls diverse EtBr-Alternativen unter die Lupe. Über Absorptionsanalysen, Dünnschicht-Chromatografie, LC-MS sowie HPLC fanden sie heraus, was sich chemisch hinter den wohlklingenden Namen der Farbstoffe verbirgt, die häufig den Zusatz „Safe“ enthalten (biotium.com/wp-content/uploads/2017/02/Gel-Stains-Comparison.pdf).
Das Biotium-Team stieß bei ihren Untersuchungen auf Einzelfarbstoffe und Mischvarianten. Am häufigsten in diesen vertreten war Acridin-Orange, etwa als alleiniger Farbstoff in RedSafe und SafeView beziehungsweise in Kombination mit DAPI in MidoriGreen und GreenSafe. EZ-Vision enthält nur DAPI, SaveView FireRed dagegen Propidiumjodid. Dazu gibt es noch Exoten wie SYBR-Safe und Nancy-520 mit einem jeweils eigenen Farbstoffmolekül.
EZ-Vision verfügt über die geringste Sensitivität. Um ein Vielfaches empfindlicher sind die von Biotium hergestellten Farbstoffe GelRed und GelGreen. Leider bleibt die Zusammensetzung dieser beiden Farbstoffe ein Firmengeheimnis.
Aber ob giftig oder nicht, alles was DNA anfärbt, fasst man besser nur mit Handschuhen an. Acridin-Orange-basierte Farbstoffe können Membranen durchdringen. Das macht sie einerseits gesundheitsgefährdend, andererseits aber interessant als Agens zur Lebendzellfärbung. Weihnachtsstern-Protoplasten werden zum Beispiel mit MidoriGreen richtig hübsch (Plant Methods 8:14).
Todd Gruber und seine Kollegen von der Newport University in Virginia, USA, fanden einen simplen Ersatz für SYBR-Safe und pfeifen auf kommerzielle Produkte: „SYBR Safe...has excellent sensitivity... but suffers from prohibitively high costs”, schreiben sie in ihrem Paper (Electrophoresis 39: 1474-77). Da schwingt der Vorwurf von Abzocke mit, also muss es doch billiger gehen? Tut es. Die Lösung heißt Thiazol-Orange (TO) – die Ausgangssubstanz für die Herstellung von SYBR-Safe.
Grubers Gruppe verglich im Pre-Casting-Verfahren die DNA-Agarose-Gel-Färbung mit Thiazol-Orange, SYBR-Safe und EtBr. Die Detektionsgrenze lag jeweils bei etwa einem bis zwei Nanogramm DNA pro Spur. Auf den ersten Blick sehen die Formeln für SYBR-Safe und TO identisch aus. Einziger Unterschied: TO enthält eine N-Methyl – SYBR-Safe eine N-Propylgruppe. So ganz neu ist TO als DNA-Farbstoff nicht, wurde aber angesichts seiner Eigenheit, DNA nur reversibel zu binden bisher ignoriert. Offenbar stört das aber gar nicht. Wie SYBR-Safe lässt sich auch TO mit Blaulicht bei 470 nm anregen, wodurch Schäden an der DNA vermieden werden – im Gegensatz zur Anregung mit UV-Licht.
Die Auswirkungen von UV-Licht auf Plasmid-DNA sollte man nicht unterschätzen. Grubers Mitarbeiter waren sehr überrascht von den Ergebnissen, die sie erhielten, wenn sie Plasmid-DNA in den Gelen für eine Sekunde mit UV-Licht bestrahlten, bevor sie diese für die Transformation von E. coli einsetzten. Schon diese eine Sekunde genügte, um die Zahl der Kolonien auf den Platten zu verringern. Bestrahlten die US-Amerikaner die Plasmid-DNA dreißig Sekunden mit UV-Licht, sank die Zahl der E.-coli-Kolonien um mehr als 99 Prozent.
Ob TO wie SYBR-Safe das Laufverhalten der DNA beeinflusst, testete Grubers Team nicht. Da Hall mit SYBR-Safe bei DNA von mehr als vier Kilobasenpaaren Länge im Pre-Casting-Verfahren jedoch Ungereimtheiten fand, ist dies nicht ausgeschlossen.
Einen etwas anderen Weg, die Detektion von DNA in Agarose-Gelen zu optimieren, beschritt Ken Motohashi von der Universität Kyoto. Er konzentrierte sich auf die Farbstoffe MidoriGreen und SafelookGreen, die mit Blaulicht anregbar sind und somit das Risiko von UV-Schäden umschiffen – bei der Sensitivität aber nicht sonderlich glänzen. Motohashi fand jedoch einen Trick, mit der sich die Empfindlichkeit dieser Farbstoffe auf das Niveau von EtBr anheben lässt. Hierfür entwickelte er ein spezielles Beleuchtungssystem mit zusätzlichen Filtern (PLoS ONE 14(9): e0222209).
Der Farbstoff wird mit blauem LED-Licht von 490 bis 495 Nanometern angeregt. Um Störungen durch reflektiertes Licht auszuschalten, baute Motohashi einen Kurzpass-Filter in den Anregungs-Lichtweg ein, der längere Wellenlängen über 510 Nanometer blockiert. Das gefilterte Anregungslicht trifft auf das gefärbte Gel und regt den Farbstoff zur Fluoreszenz an. Um auch hier störendes Hintergrundrauschen zu eliminieren, integrierte der Japaner einen zusätzlichen Langpass-Filter (540 nm) in den Lichtweg des emittierten Lichts. Wer mit präparativen Gelen hantiert, kann sich diesen Geräteteil sparen und stattdessen einfach eine Brille mit orangen Gläsern aufsetzen. Motohashis selbstgebasteltes Detektions-System für DNA-Agarose-Gele kostet keine 300 Euro und ist damit um einiges günstiger als ein UV-Transilluminator.