(11.03.2020) 3D-Biodrucker sollen menschliche Gewebe und Organe in nicht allzuferner Zukunft nach Bedarf anfertigen. Open-Source-Geräte erleichtern den Zugang zu dieser Technologie, die aber noch einige Hürden überwinden muss.
Kommerziellen Anbietern von 3D-Biodruckern könnte Nils Beßlers Masterarbeit, in der er den Eigenbau eines günstigen, zellschonenden Biodruckers beschreibt, ein Dorn im Auge sein. Denn der Open-Science-Gedanke ist für ihn von entscheidender Bedeutung. „Bioprinting-Firmen machen einen tollen Job, müssen aber verständlicherweise ihre Entwicklungskosten reinholen“, erklärt er. „Außerdem bieten sie aus Forscherperspektive komplexe Systeme an, die relativ schwierig zu modifizieren sind, um eigene Ideen zu testen. Der Anspruch unserer interdisziplinären Gemeinschaftsarbeit war es deshalb, den Zugang zu dieser Technologie zu vereinfachen, indem wir einen kostengünstigen Biodrucker bauen und Hardware, Software und Wetware detailliert und frei zugänglich im Internet dokumentieren.“
Für Neueinsteiger klingen 3D-Biodrucker wie dem Star-Trek-Universum entliehen: In diesem synthetisieren Replikatoren auf Knopfdruck Objekte, wie zum Beispiel künstliche Ersatzorgane, aus dem Nichts und benötigen dazu nur ihre atomare Struktur als Vorlage. Reale Biodrucker arbeiten noch nicht auf molekularer Ebene, folgen aber der gleichen Grundidee: Ein 3D-Scanner nimmt mithilfe von Tomographie, Magnetresonanz oder Ultraschall zum Beispiel die Topographie einer Hautwunde oder die Anatomie eines Hüftgelenks auf – und zwar auf den Mikro- oder Nanometer genau. Eine Konstruktionssoftware zerschneidet die virtuellen 3D-Objekte in zweidimensionale Schichten und überführt deren Positionsinformationen in eine Abfolge von Programmanweisungen. Diese steuern die Position eines Druckkopfs, der das Gewebe Schicht um Schicht aus einer biologischen Tinte (Bio-Ink) aufbaut.
Passt auf jede Bench: Der NOSE-Biodrucker, den Rawas Ahmmed, Nils Beßler, Dennis Ogiermann, Alexander Santel und Maj-Britt Buchholz (v.l.n.r.) an der Ruhr-Universität Bochum konstruierten. Foto: Nils Beßler
Bio-Tinte besteht aus Zellen oder multizellulären Sphäroiden, die in stabilisierenden Trägermaterialien suspendiert sind. Als Matrixsubstanzen eignen sich Hydrogele aus organischen Polymeren, zum Beispiel Alginat, Agarose, Gelatine, Kollagen, Fibrinogen und Nanozellulose oder aus synthetischen Polymeren, etwa biologisch abbaubares Polycaprolacton und Polyurethan. Alternativ kann auch erst ein Strukturrückgrat, etwa aus Calciumphosphat-Zement, gedruckt werden, das als Grundlage einer 3D-Zellkultur dient.
Kommerzielle 3D-Biodrucker kosten aber meist zehn- bis hunderttausend Euro und sind in der Regel geschlossene, patentrechtlich geschützte Systeme.
Beßlers NOSE-Biodrucker, den er zusammen mit vier weiteren Studenten entwickelte, die Beate Brand-Saberi an der Ruhr-Universität Bochum betreute, folgt dagegen vor allem zwei Idealen: „Offenheit und Simplizität“. Beßler führt weiter aus: „Es existieren einige gute Open-Source-3D-Drucker, die aber nur Gruppen-intern dokumentiert werden. Das erschwert die Reproduzierbarkeit. Unser Biodrucker basiert auf dem Prusa i3 des RepRap-Projekts, also dem bestdokumentierten und am häufigsten verwendeten Open-Source-3D-Drucker der Welt. Der Bio-Umbau kostet etwa hundert Euro, je nachdem, woher die nötigen Einzelteile stammen. Um ihn von Null aufzubauen, sind circa tausend Euro Materialkosten nötig.“
Ein umfangreiches Wiki zum Selbstaufbau des Prusa i3 findet sich unter reprap.org/wiki/Prusa_i3. Die Modifikationen zum Biodrucker dokumentieren Beßler et al. in der Zeitschrift HardwareX (doi: 10.1016/j.ohx.2019.e00069).
Bescheiden erklärt Beßler: „Die ganze Vorarbeit hat die RepRap-Gemeinde geleistet. Wir haben den Prusa nur um Biodruck-spezifische Extrusions-Hardware und Software sowie um biokompatible Protokolle erweitert.“
Die Extrusion ist eine von mehreren Druck-Technologien, die bei Biodruckern eingesetzt werden. Etwa achtzig Prozent aller Biodrucker nutzen diese Technik, bei der ein kontinuierlicher, viskoser Strom eines Biomaterials aus einer mechanisch oder pneumatisch getriebenen Spritze gedrückt beziehungsweise extrudiert wird.
Bio-Inkjet-Systeme platzieren dagegen Pikoliter-Tropfen entweder piezoelektrisch oder mittels thermisch erzeugter Luftbläschen. Biodrucker mit Laser-induziertem Vorwärtstransfer (LIFT) deponieren wiederum evaporierte Tröpfchen aus Biomaterial auf eine Empfängerfläche.
Beßler erklärt, warum er die Extrusion favorisiert: „Die Extrusionstechnologie ist geradlinig, kosteneffektiv, am besten dokumentiert und verfügt über eines der größten Anwendungspotenziale, gerade mit Blick auf geometrisch komplexe Strukturen und das Drucken von Hohlräumen.“ Er erläutert außerdem, warum die Gewebestabilität eine der gegenwärtigen Herausforderungen beim Biodruck ist: „Komplexe dreidimensionale Objekte lassen sich nur schwer realisieren, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen durch die nötige hohe Biomaterialkonzentration zu mindern. Knorpelgewebe mit einer geringen Zelldichte lässt sich deshalb leichter drucken als sensitive und typischerweise hochkonzentrierte neurale Zellen.“
Selbst an Bord der Internationalen Raumstation wird an der Lösung dieses Problems gearbeitet. Die dort untergebrachte 3D-Bio-Fabrication-Facility demonstrierte im letzten Januar, dass Herzmuskel- und Nervenzellen in der Schwerelosigkeit ohne Stabilität-verleihende Matrixsubstanzen gedruckt werden können (techshot.com/bioprinter). Vielleicht ist die Star-Trek-Welt doch nicht mehr so weit entfernt.
In irdischen Laboren sind hierzu aber noch einige technische Kniffe notwendig. Beßler dazu: „Die Stabilität künstlichen Gewebes hängt von seiner Trägersubstanz ab. Aus Alginat können wir zum Beispiel einfache Gewebegeometrien und extrazelluläre Matrizen herstellen. Allerdings bietet es tierischen Zellen keine Adhäsionsmöglichkeiten und erfordert somit chemische Modifikationen oder Bio-Ink-Kombinationen mit Kollagen. Reicht das aber für alle Gewebetypen aus? Die geringste Stabilität – genauer gesagt, das geringste elastische Widerstandsmoment – im menschlichen Körper weist das zentrale Nervengewebe mit 0,2 bis 2 Kilopascal auf. Um Bio-Tinten mit so geringer Viskosität drucken zu können, haben wir unseren Bio-Prusa mit dem FRESH-Protokoll von Andrew Feinbergs Labor an der Carnegie Mellon University in Pittsburgh kombiniert.“
Das Akronym FRESH steht für Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels. Die 3D-Geometrie wird bei dieser Technik nicht auf eine flache Oberfläche gedruckt, sondern in ein Stützmaterial zum Beispiel aus Gelatine. Diese temporäre Hülle wird im Anschluss bei 37 °C verflüssigt. Hierdurch ist es möglich Zellen nicht nur Schicht um Schicht, wie bei herkömmlichen Extrusions-Druckern, sondern punktuell nach Wunsch zu platzieren. Objekte aus sensitiven Zellen lassen sich so mit geringen Konzentrationen an Kollagen, Alginat oder Fibrin in anatomisch relevanter Größe erzeugen. Auch können dem Stützmaterial Vernetzungsmittel beigemischt werden, um die Formtreue gedruckter Objekte zu verbessern (Science 365, (6452): 482-87).
Beßler sieht aber eine weitere Hürde: „Mit FRESH können wir instabile Konstrukte drucken. Und es schützt sogar vor deren Austrocknung. Aber auch Gelatine-Bäder gewährleisten nicht die Versorgung des gedruckten Gewebes. Je länger die Objekte im Stützbad verweilen, desto geringer ist die Überlebensrate ihrer Zellen.“ Die Bochumer quantifizierten deshalb die Überlebensfähigkeit verschiedener Zelllinien, unter anderem muriner embryonaler Stammzellen und humaner Nierenzellen. Die Mortalität verringerte sich von knapp fünfzig auf fünfzehn Prozent, wenn sie statt zwei Stunden nur eine Stunde im Gelatine-Bad verweilten (HardwareX. doi: 10.1016/j.ohx.2019.e00069).
Beßler prognostiziert: „Durch Zugabe von Nährmedien und Wachstumsfaktoren zum Stützbad sollten auch längere Druckzeiten möglich sein. Außerdem hängen Überlebensrate und Druckbarkeit davon ab, welche Adhäsionsmotive das Biomaterial für die Zellbindung enthält. Zellverbünde, wie zum Beispiel Sphäroide oder Organoide, fühlen sich auch ohne Adhäsion an eine extrazelluläre Matrix wohl – einzelne Zellen jedoch selten.“ Trotz dieser Hürden erlaubt es FRESH bereits, verkleinerte Modelle menschlicher Organe aus zwanzig bis zweihundert Mikrometer durchmessenden Kollagenfilamenten zu drucken (Science 365 (6452): 482-7).
Natives Nervengewebe, zum Beispiel im humanen Rückenmark, enthält außerdem bis zu mehrere zehntausend Nervenzellen pro Milligramm Gewebe. Diese physiologisch relevanten Konzentrationen verklumpen die winzigen Spritzenöffnungen Extrusions-basierter Biodrucker. Außerdem überleben nur wenige Prozent der Zellen die hierbei auftretenden Scherspannungen. Und zu allem Überfluss muss das gedruckte Gewebe auch noch künstlich mit Nähr- und Sauerstoff versorgt werden, was die gegenwärtig vielleicht größte technische Hürde darstellt. Noch begrenzt die eingeschränkte Vaskularisierung klinisch relevantes Gewebe auf wenige Kubikmillimeter.
Beßler nennt jedoch einen Lösungsansatz: „Inverse Extrusions-Printer drucken nicht das Biomaterial in der gewünschten Form: Sie drucken die Form in das gewünschte Biomaterial.“ Damit verweist er auf eine von Jennifer Lewis Gruppe an der Harvard School of Engineering and Applied Sciences entwickelte Methode namens SWIFT (Sci Adv. doi: 10.1126/sciadv.aaw2459). Er erklärt: „SWIFT steht für Sacrificial Writing Into Functional Tissue. Diese Methode druckt ein Netzwerk von Gelatinekanälchen in dicht gepackte Zellhaufen, wie zum Beispiel Organoide oder multizelluläre Sphäroide, um sie kurz darauf zu liquifizieren und mit oxygeniertem Medium zu fluten.“ Der Druckvorgang schiebt Zellen nur aus dem Weg, ohne sie zu beschädigen. Die entstehenden 0,4 bis 1 Millimeter weiten Kanälchen können im Anschluss sogar mit Endothelzellen ausgekleidet werden, um Blutgefäße noch besser nachzuahmen.
Die Zukunft des Bioprinting sieht Beßler indes in akustischen und optischen Verfahren der Gewebekonstruktion: „Sogenannte Acoustic Levitation und Volumetric Light-based Bioprinting-Verfahren erreichen viel höhere Auflösungen als Extrusions- und Inkjet-Drucker und reduzieren die benötigte Zeit für das Drucken von Stunden auf Sekunden. Hierdurch wirken auch die Scherkräfte, die die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen, nur sehr kurz auf die Zellen ein.“ Die akustische Levitation positioniert kleine Proben in die Druckknoten eines stehenden Ultraschallfeldes und bringt so zum Beispiel Styroporkügelchen und Wassertropfen zum Schweben. Multizelluläre Sphäroide können mit 3D-akustischen Pinzetten bereits hergestellt werden (Lab Chip 16: 2636-43).
Dagegen funktioniert der Holographie-basierte 3D-Druck wie eine umgekehrte Computertomographie. Zweidimensionale Lichtbilder werden aus allen Richtungen auf ein zylindrisches Gefäß projiziert, das mit photopolymerisierbarem Hydrogel gefüllt ist. Je nach dreidimensionalem Lichtmuster, also der jeweiligen Lichtdosis an allen Punkten innerhalb dieser 3D-Projektion, polymerisiert das Hydrogel in die gewünschte Form. Es quervernetzt nur dort, wo multiple Lichtprojektionen konstruktiv interferieren, wodurch die Gelierungs-Schwelle überschritten wird. Das Ganze dauert nur noch Sekunden. Die biomedizinischen Möglichkeiten des Verfahrens hat Riccardo Levatos Gruppe am University Medical Center Utrecht beschrieben (Adv Mater. doi: 10.1002/adma.201904209).
Und weil die Holographie-Druck-Technik so spannend ist, hat Nils Beßler seine Doktorarbeit vor kurzem in der Utrechter Arbeitsgruppe von Anne Rios mit Blick auf komplexe In-vitro-Modelle begonnen.