Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Freier Fluß für Proteine!

von Hubert Rehm

Unser Proteinmethodiker Hubert Rehm war wieder in der Zeitschriftenabteilung des Freiburger Max-Planck-Instituts. Neues zur Isoelektrischen Fokussierung (IEF) hat er gefunden.

Jeder weiß es: Proteomics ist groß in Mode. Aber nicht jeder weiß warum. Am wenigsten die, die sich täglich damit beschäftigen müssen. Zum einen läßt der große Knaller, sei er therapeutischer, sei er nobelpreismäßiger Natur, noch auf sich warten. Zum anderen ist das technische Grundproblem dieser Forschungsrichtung noch ungelöst: sämtliche Proteine einer Zelle nach Qualität und Quantität aufzutrennen gelingt maximal mit 10% der Proteine und nur mit einer Auswahl, mit den häufigen und den löslichen.

Die Königsmethode ist bekanntlich das 2D-Gel. Zuerst werden die Proteine mit isoelektrischer Fokussierung nach den isoelektrischen Punkten getrennt, danach, in einem SDS-Gel, nach den Molekulargewichten. Der philosophischen Tiefe wegen heißt das erste und zweite Dimension. Verwendet man für die erste Dimension immobilisierte pH-Gradienten, ordnen sich die Proteine in ein reproduzierbares Fleckenmuster. Gemessen am Anspruch der Proteomiker ist damit jedoch nicht viel gewonnen. Was sind die Probleme?

• Problem 1: Integrale Membranproteine schmieren in IEF-Gelen und fokussieren nicht.
• Problem 2: Die Menge an Protein, die sich auf ein Gel aufladen läßt ist begrenzt. Lädt man zuviel, trennt es schlecht.
• Problem 3: Proteine adsorbieren an die Polyacrylamidmatrix.
• Problem 4: Das Medium, in dem fokussiert wird, darf keine Salze enthalten. Nicht jedem Protein gefällt das.
• Problem 5: Am isoelektrischen Punkt fallen viele Proteine aus.
• Problem 6: Die Mengen der einzelnen Proteine eines Zellextraktes unterscheiden sich bis zu einem Faktor von einer Million. Selbst wenn es eine Methode gäbe, die auch geringste Mengen anfärbt, die fetten Blobs der häufigen Proteine würden diese zudecken.

Nun ruht der Forschergeist nie. Auch in der IEF-Dimension tummelt er sich und es ist ihm gelungen, den einen oder anderen Schatz zu heben. Fangen wir mit der Fortentwicklung einer klassischen Methode an, der isoelektrischen Fokussierung (IEF) in Freiflußelektrophorese-(FFE)-Geräten. Erfunden hat sie Kurt Hannig vor etwa vierzig Jahren.

Das Prinzip: Zwischen zwei Glasplatten läuft ein breiter Strom von in Wasser gelösten Ampholyten (und ggf. Zusätzen). Links und rechts sitzen Elektroden und erzeugen quer zum Strom ein elektrisches Feld. Es bildet sich ein pH-Gradient. Treiben in dem Flüssigkeitsstrom Proteine mit, wandern sie seitwärts zu ihren isoelektrischen Punkten. Oben (oder unten) wird der Flüssigkeitsstrom fraktioniert. Das klingt so einfach wie ein Wankel-Motor, doch wie bei dem saß auch hier der Teufe im Detail. Es gab Probleme mit der Diffusion der Elektrodenprodukte in die und der Präzipitaion der Proteine in der Trennkammer, mit den Totvolumina bei den Sammelauslässen, mit dem Halbmondeffekt, mit dem Fremdwort elektrohydrodynamische Dispersion und mit der Hitzeableitung. Die klassische isoelektrische Fokussierung in FFE-Geräten hatte sich deswegen nicht richtig durchgesetzt – wie der Wankel-Motor auch.

Herrn Weber sei Dank!

Dank der unermüdlichen Tüftelei eines Gerhard Weber sind jedoch heute einige dieser Probleme zumindest teilweise gelöst. So werden die Totvolumina bei den Sammelauslässen mit Gegenfluß unterdrückt, die elektrohydrodynamische Dispersion bleibt dem heutigen Anwender ein Fremdwort (u. a. dank wandfreier Injektion der Probe) und es ist auch gelungen, die Diffusion von Elektrodenprodukten in die Trennkammer zu unterbinden. Droht Präzipitation, so hilft es, die Probe nicht konzentriert durch den Probeneinlass, sondern verdünnt über den Laufmitteleinlaß einzugeben (Hoffmann et al. 2001, Proteomics 1, 807). Die Präzipitation sollten Sie nicht unterschätzen: Sie senkt nicht nur die Ausbeute bis auf Reste ab, sie verringert auch die Auflösung. Das Präzipitat verzerrt den Flüssigkeitsstrom wie ein Unfal den Autofluß auf einer sechsspurigen Straße. Idiotensicher ist die Methode auch heute noch nicht: Für jede neue Probe müssen Sie herumspielen mit Flußrate (zu langsam droht Präzipitation, zu schnell schlechte Fokussierung), Proteinkonzentration, Feldstärke und Zusätzen zum Laufmedium. Aber was ein rechter Forscher ist, der spielt ja gerne. Dies umsomehr, als die IEF in FFE-Geräten ansehlichen Gewinn bietet:

Es gibt keine Matrix, also kann sie auch keine Proteine adsorbieren, d. h. Sie können mit einer hohen Ausbeute rechnen (96-98 %). Des weiteren handelt es sich um eine kontinuierliche Methode, es läßt sich also beliebig viel Protein auftragen. Integrale Membranproteine, die in nichtionischen Detergenzien löslich sind, müssten sich mit der FFE fokussieren lassen. In der Tat weisen FFE Freaks immer auf diese Möglichkeit hin, ich habe aber bisher kein Paper gefunden, wo das beeindruckend gezeigt worden wäre. Woran mag das liegen? Aggregation in der Nähe des isoelektrischen Punktes? Ungenügende Solubilisierung? Zur Lösung des letzteren Problems ist das Wundermittell Thioharnstoff vorgeschlagen worden (Vorsicht: Ist schlecht wasserlöslich und geht nur mit Harnstoff in Lösung, üblich sind 2M Thioharnstoff + 6M Harnstoff). Auch neue Sulfobetain-Detergenzien wie ASB-14 und C8O sollen integralen Membranproteinen beim Schwimmen helfen. Probieren Sie's aus.

Womit? Hier ein Vorschlag: Fokussieren Sie den gereinigten Shaker K+-Kanal (PNAS 1988 85, 4919) in einem FFE-Gerät. Mal mit Thioharnstoff und Sulfobetainen, mal ohne Harnstoff und in Triton X-100. Der Kanal braucht zwar K+-Ionen für seine native Konformation, aber das heißt ja nicht, daß er ohne K+ in der Ampholyt Brühe ausfallen muß. Läßt sich der gereinigte Kanal fokussieren, könnte man auf diese Weise z.B. unterschiedlich phosphorylierte K+-Kanal-Spezies isolieren. Ein schneller Versuch, ein schnelles Paper.

Aber nicht zu früh gejubelt, lieber Leser! Die IEF in einem FFE-Gerät hat Nachteile. Zum einen ist der Apparat teuer. Und hinterher finden Sie ihre Probe in einer Lösung wieder, die nicht nur Ampholyte, sondern auch Hydroxypropylmethylcellulose enthält. Diese Verbindung begleitet nicht alles, was Sie hinterher mit der Probe anfangen, mit gutmütigem Kopfnicken. Sie brauchen das Zeug aber beim Lauf, sonst wird die Trennung schlecht. Zum Ausgleich bietet die klassische FFE technische Flexibilität, so können Sie damit nicht nur isoelektrisch fokussieren, sondern auch eine Isotachophorese oder eine Zonenelektrophorese durchführen. Mit Isotachophorese kann man im FFE-Gerät Organellen auftrennen – was immerhin schon einmal zu einem Nature-Artikel gereicht hat (Amigorena et al. 1994, Nature 369, 113-120).

Aber wir wollen ja Proteomics treiben. Hier hilft die IEF im FFE-Gerät insofern, als sie Ihnen ihre Probe in maximal 96 Fraktionen vorfraktioniert. Die zweite Dimension bestünde dann in 96 SDS-Gelen. Viel Spaß.


Vergleichsweise spaßlos

Wenig Spaß werden Sie haben, wenn Sie das gewonnene Proteinprofil mit dem anderer Gruppen vergleichen. Beim gleichen Experimentator und von Tag zu Tag ist der pH-Gradient eines FFE-Geräts zwar erstaunlich reproduzierbar (die Abweichung liegt bei nur 0,05 pH-Einheiten) aber ob das für verschiedene Arbeitsgruppen gilt, wage ich zu bezweifeln.

Gut eignet sich die Methode zur Reinigung eines bestimmten Proteins, besonders eines solchen, dessen isoelektrischer Punkt abseits der großen Herde weidet. Die IEF im FFE-Gerät kann schnell große Mengen verarbeiten. Dann die hohen Ausbeuten! Und den isolektrischen Punkt ihres Proteins lernen Sie auch kennen. Falls Sie auf den Harnstoff im Laufmedium verzichten können, nimmt die native Konformation vieler Proteine eine IEF nicht übel, d. h. Sie können ihr Protein hinterher per Enzym- oder Bindungstest nachweisen. Ist das Protein Substrat einer Kinase, ließe sich sogar eine ingeniöse Doppelreinigung ins Werk setzen: Das Protein per FFE isoelektrisch fokussieren, die erhaltene Fraktion mit Phosphatase behandeln und wieder isoelektrisch fokussieren. Die Reinigungswirkung müsste gewaltig sein.

Soviel zur Weiterentwicklung der IEF im klassischen FFE-Gerät. Es gibt jedoch bei der IEF auch völlig neue Ansätze. Davon in der nächsten Folge, wenn es wieder heißt: Freier Fluß für Proteine!




Letzte Änderungen: 08.09.2004