In-situ-Nachweis mittels der Enzym-Gold-Technik

Am Bilde hängt, zum Bilde drängt doch alles...

Patrick M. Heidrich

Heute schon markiert? Gemeint ist nicht die eigene Workbench – wer glaubt, dem räumlichen Ausdehnungsdrang der lieben Kollegen mit Duftmarken Einhalt gebieten zu müssen, braucht wohl Urlaub. Nein, es geht um den in situ-Nachweis mit der Enzym-Gold Technik.

Eine Northernanalyse mag ja ihre Reize haben, aber seien Sie mal ehrlich: Haben Sie nicht auch schon mit dem Schlafe gerungen, wenn in einem Vortrag dutzende mehr oder weniger graue Banden, beschriftet mit kryptischen Kürzeln, vor Ihren Augen entlangflimmerten?!? Ein Aktivitätsnachweis in einem Zelllysat oder Kulturfiltrat mag ja hochspannend sein, aber wäre es nicht noch tausendmal spannender, wenn Sie an einem histologischen Präparat zeigen könnten "Hier genau wird Protein X sekretiert, ...hier findet sich das Substrat von Hydrolase Y."?

Machen wir uns nichts vor, was ist die ultimative Methode, um ein Paper aufzupeppen und die Referees zu beeindrucken? Bildchen! Diese werden auch gerne als mikrofotografische Dokumentationen bezeichnet. Den höchsten Schauwert haben meiner Erfahrung nach fluoreszenzmikroskopische Bilder (die ideale Verknüpfung von Ästhetik und wissenschaftlicher Aussagekraft) gefolgt von REM-Dokus. TEM-Dokus sind da schon mehr was für die Insider, die Ahnung von der Verteilung der verschiedenen Gewebetypen haben, ein gewisses räumliches Abstraktionsvermögen besitzen und TEM-Mikrografien interpretieren können.

Unsichtbares wird sichtbar: kolloidales Gold

Aber wenden wir uns wieder dem eigentlichen Thema zu, dem in situ Nachweis. Nun, da gibt es seit ungefähr zwanzig Jahren die Technik der Markierung mittels kleiner kolloidaler Goldkörnchen als Sonden. Alles, was Sie dazu brauchen, sind ein paar Schnitte (im Slang als Semis (0,3-1 µm Dicke, für LM) oder Ultras (40-80 nm Dicke, für TEM) bezeichnet), eine geeignete Sonde, eine feuchte Kammer und natürlich einen oder mehrere Puffer. Ein TEM wird sich sicherlich auch irgendwo innerhalb des Fachbereiches / der Uni zwecks Auswertung auftreiben lassen, und wenn nicht: es geht auch mit weniger Aufwand (siehe: "Schweigen ist Gold, Reden ist Silber..."

Jetzt ist vielleicht der Punkt gekommen, an dem Sie, verehrte(r) Leser(in), milde lächelnd abwinken und sagen "Kennen wir doch alles. Enzym-Gold-Sonde (Antikörper) auf die Schnitte hauen, kurz inkubieren, noch ein bißchen waschen (im Falle des AK noch den sekAK inkubieren) und fertig ist der in situ-Nachweis."

Schonwaschgang für Goldpartikel...

So einfach ist es tatsächlich – in der Theorie. In der Praxis gilt es, das sogenannte "Spezifische Fenster" zu finden. Am Beispiel der Immundetektion von Proteinen im "Western Blot" soll die Problematik des "spezifischen Fensters" näher erläutert werden: Verdünnt man einen Antikörper zu stark, ist nach der Entwicklung des Blots nichts zu sehen, verdünnt man ihn nicht hoch genug, ist unspezifische Adsorption die Folge und nach der Entwicklung nur "Schmier" zu sehen, sprich: keine scharf abgesetzten Banden. Somit gilt es, in Vorversuchen die geeignete Verdünnung zu ermitteln. Das "spezifische Fenster" kann aber auch durch Veränderung der Parameter "Intensität der Waschschritte" oder "Dauer der Entwicklung des Blots" eingestellt werden. Ähnliches gilt in der Enzym-Gold Technik.

Zusätzlich kann es passieren, dass die nicht unverrückbar fest an die Substrate gebundenen Enzym-Gold Sondenpartikel während der Waschvorgänge delokalisieren (ein bißchen von der eigentlichen Targetregion wegrutschen), oder – noch schlimmer – wieder völlig von der Schnittoberfläche verschwinden. Im zweiten Fall weiß man noch nicht mal, ob es wenigstens prinzipiell klappen könnte.

Wo ist es denn nun, das Fenster?

Mit dem Finden des "spezifischen Fensters" hatte auch ich zu kämpfen. Wusch ich zu lange, war nichts zu sehen. Wusch ich zu kurz, war das Rauschen der unspezifischen Adsorbtion zu hoch. Wusch ich so mittig, erhielt ich zwar eine spezifische Markierung (die Goldpartikel beschränkten sich auf pflanzliche Zellwände), hatte oft aber mit dem Phänomen der Delokalisation zu kämpfen. Als Grund für diese Delokalisation machte ich die Kräfte verantwortlich, die während der Überführung des Netzchens (siehe Glossar!) von Tropfen zu Tropfen auf dessen Oberfläche einwirkten (für Nicht-Mikroskopiker: der netzartige Objektträger wird nacheinander auf drei bis sieben Tropfen Waschpuffer gelegt).

Abhilfe schaffen sollte ein kontinuierlicher Waschvorgang. Der Tropfen mit der Enzym-Gold Sonde wurde an zwei Seiten mit Kapillarschläuchen, in denen Waschpuffer vorgegeben war, in Kontakt gebracht. Nach Beendigung der Inkubation wurde mittels einer peristaltischen Pumpe ein kontinuierlicher Strom von Waschpuffer unter dem Netzchen durchgezogen. Das Fördervolumen betrug etwa 0,5 ml/min. Nach dem Waschvorgang wurde noch Glutaraldehyd zur zusätzlichen Vernetzung der gebundenen Goldsonden zugesetzt und nochmals kurz gespült.

Lohn des ganzen Aufwands: Ich hatte endlich meine Markierung "im Sack". Der Aufbau der Apparatur ist natürlich etwas "frickelig", insbesondere die Synchronisation der Zu- und Ablauf-Förderleistung (aber das kann natürlich auch an der Fertigungstoleranz der verwendeten Silikonschläuche liegen). Ist jedoch das Set erst einmal zusammengebaut, so kann man es immer wieder verwenden. Ein wenig akademische Bastelei hat noch niemandem geschadet.


Schweigen ist Gold,
Reden ist Silber...

Sie haben kein TEM und das Pendeln zwischen Institut A und Institut B mit der Gridbox in der Tasche ist auch nicht Ihr Ding? Naja, kann man verstehen, TEMs sind (immer noch) groß, teuer in der Anschaffung, stehen meist nutzlos in der Gegend herum und jemand, der sich auskennt, muß auch noch mit verfügbar sein (ganz zu schweigen von der Laborinfrastruktur). Macht nichts! Sind die Goldpartikel erst einmal dem Schnitt auf den Leim gegangen, kann man sie auch lichtmikroskopisch sichtbar machen, beispielsweise mit Hilfe der Silberverstärkung. Dabei wird unter reduzierenden Bedingungen gelöstes Silbersalz auf der Schnittoberfläche inkubiert. Das sich bildende metallische Silber schlägt sich bevorzugt auf den Goldpartikeln nieder (diese dienen quasi als Kondensationskerne). Wenn man lange genug verstärkt, sind die Silberablagerungen so dick, daß sie lichtmikroskopisch sichtbar werden.

Für die Silberverstärkung werden natürlich Kits angeboten, es geht aber auch einfacher und billiger. Hier ein kleines Rezept zum silberverstärken (entnommen aus einer alten Fotolabor-Rezeptsammlung der VEB AGFA Wolfen von 1957; es diente eigentlich zum Verstärken von zu flauen photografischen Negativen).

Erst einmal mixen wir uns die folgenden zwei Stammlösungen A (300 mg Hydrochinon, 300 mg Citronensäuremonohydrat, ad 100 ml mit ddH₂O) und B (500 mg Silbernitrat Ag(NO₃)₂ ad 10 ml mit ddH₂O).

Durchführung der Verstärkung:

Zum Gebrauch werden zehn Teile Lsg. A unmittelbar vor dem Einsatz mit 1 Teil Lsg. B versetzt. Durchgeführt wird die Verstärkung in einem verdunkeltem Raum mit einer kleinen Leselampe in einiger Entfernung (echte Dunkelkammerbedingungen sind zwar förderlich, aber nach meiner Erfahrung nicht unbedingt erforderlich). Die Verstärkungslösung ist nur etwa 30 Minuten lang gebrauchsfähig, da nach einer gewissen Zeit auch Silberkeime in freier Lösung entstehen, die ausfallen und so den Hintergrund erhöhen.

Die durchschnittliche Dauer der Silberverstärkung beträgt etwa 30-45 Minuten (je nach Intensität des Primärsignals). Zur Kontrolle des Verstärkungsgrades kann die Verstärkung durch Spülen mit ddH₂O unterbrochen, das Präparat uneingedeckt mikroskopiert und gegebenenfalls mit frisch angesetzter Verstärkungslösung weiter verstärkt werden. Nach Abschluß der Verstärkung werden die Präparate luftgetrocknet. Eine Kombination der Silberverstärkungstechnik mit anderen Färbungen ist möglich. Ein Nachteil der Silberverstärkung ist der Verlust des hohen Auflösungsvermögens der TEM-Analyse.

Fragen? Anregungen? Korrekturen? Mailen Sie mir: patrick.heidrich@uni-muenster.de

Kleines Glossar für Nicht-Elektronenmikroskopiker
Gridbox:		Kleine Plastikgefäße, in denen die Netzchen transportiert und aufbewahrt werden.
LM:		Lichtmikroskopie
Netzchen:		In der gTEM genutzte, netzartig strukturierte Objektträger aus Kupfer, Nickel, Gold oder anderen Werkstoffen.
REM:		Rasterelektronen-Mikroskopie
TEM:		Transmissionselektronen-Mikroskopie

Letzte Änderungen: 08.09.2004