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Hochqualitative Daten in der Mikrobiom-Forschung


Zymo Research Europe GmbH
Mülhauser Straße 9
79110 Freiburg im Breisgau
Tel. +49 (0) 761 6006871 0

www.zymoresearch.de


Die Herausforderungen in der Mikrobiomik

Die Mikrobiom-Forschung hat in den letzten Jahren eine rasante Entwicklung erlebt, u.a. durch den technischen Fortschritt und die preislich attraktivere Verfügbarkeit der Next Generation-Sequenzierung (NGS). Mikroorganismen beeinflussen nahezu jeden Aspekt der menschlichen Gesundheit sowie unseres Lebensraums. Das Aufkommen der NGS-Technologien hat es der Wissenschaft ermöglicht, Mikroben als Gemeinschaften und nicht nur als einzelne Organismen zu untersuchen. Dies hat unser Verständnis in Bezug auf die Zusammenhänge von Mikrobiota und der menschlichen Gesundheit sowie der Umwelt revolutioniert (Zymo Research Broschüre: A Complete Microbiomics Solution – Unbiased from the Beginning). Obwohl Wissenschaftlern in dieser Zeit unzählige neue Entdeckungen gelangen, wurde die Genauigkeit/Zuverlässigkeit der verwendeten Protokolle zuvor nicht vollständig evaluiert. Die NGS basierte Mikrobiomik umfasst einen komplexen, mehrstufigen Arbeitsablauf, bei dem leicht systematische Fehler auftreten können. Zudem existiert eine Vielzahl an unterschiedlichen Protokollen auf diesem Gebiet.

Die Vielfältigkeit an Protokollen und - daraus resultierend - die enormen Variationen in der Probenbearbeitung, wurde in der Gemeinschaft als Problem erkannt und von Organisationen wie beispielsweise dem National Institute of Standards and Technology (NIST), dem Microbiome Quality Control Project (MBQC; Sinha et al., 2017) oder auch dem International Human Microbiome Standards Project (IHMS; Costea et al., 2017) charakterisiert. Die Konsequenz dieser Uneinheitlichkeit ist, dass das Feld von systematischen Fehlern übersät ist, die zu unbeabsichtigt ungenauen und nicht reproduzierbaren Daten geführt haben - nicht nur zwischen unterschiedlichen Laboren, sondern auch zwischen einzelnen Versuchen desselben Labors (Stuhlberg et al., 2016). Der allgemeine Konsens in der Gemeinschaft ist, dass ein dringender Bedarf an Standardisierung und Referenzmaterial besteht, um die Effizienz verschiedener Protokolle zu bewerten und die Reproduzierbarkeit der Daten zu gewährleisten. In keinem anderen Gebiet der wissenschaftlichen Forschung ist es denkbar, Ergebnisse als wahr zu deklarieren oder Daten zu veröffentlich, ohne fundierte Kontrollen zu verwenden, die die aufgestellte Hypothese oder eine konkrete Aussage unterstützen.

Die Lösung: Zymo Researchs vielfältiges Angebot an akkuraten Mikrobiom-Standards!

Neben den technischen Anforderungen an eine gute mikrobielle Kontrolle, ist es zudem schwierig Referenzmaterialien zu erstellen, die den Interessen jedes Forschers gerecht werden. Bei der Entwicklung eines solchen Standards arbeitete Zymo Research drei essenzielle Punkte heraus:

  1. es braucht eine genau definierte Zusammensetzung
  2. sie darf nur eine äußerst geringe Abweichung aufzeigen
  3. und sie muss die technischen Herausforderungen im Arbeitsablauf adressieren.


Unter Berücksichtigung dieser Kriterien hat Zymo Research 2016 den ZymoBIOMICS® Microbial Community Standard entwickelt, den ersten kommerziell verfügbaren Mikrobiom-Standard. Dieser enthält 10 verschiedene Stämme mit unterschiedlichem Zellwand-Aufbau (z.B. grampositive Bakterien, gramnegative Bakterien, Hefen), unterschiedlicher Zellgrößen (kleine Bakterien vs. große Hefe) und einer großen Bandbreite an GC-Gehalten (15%-85%). Das heißt, er stellt eine sehr komplexe Probe nach, wie sie in der Natur zu erwarten ist.

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Abbildung 1: Der ZymoBIOMICS® Microbial Community Standard enthält drei einfach zu lysierende Gram(-) Bakterien, fünf schwer zu lysierende Gram(+) Bakterien, sowie zwei schwer zu lysierende Hefen.
(https://files.zymoresearch.com/datasheets/ds1706_zymobiomics_microbial_community_standards_data_sheet.pdf)

Durch diese Komplexität bewältigt der ZymoBIOMICS® Mirobial Community Standard insbesondere zwei technische Herausforderungen: (1) das Erkennen von systematischen Fehlern (engl. Bias) bei der DNA-Extraktion durch ineffiziente mikrobielle Zell-Lyse und (2) Bias bei den Folge-Analysen (z.B. der Library Prep und Sequenzierung) durch unterschiedliche GC-Gehalte in der mikrobiellen DNA.

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Abbildung 2: Der ZymoBIOMICS® Microbial Community Standard wurde für den Vergleich von verschiedenen DNA-Extraktionsprotokollen verwendet. Die mikrobielle Zusammensetzung wurde mittels 16S rRNA Sequenzierung analysiert.
(https://files.zymoresearch.com/literature/pdf/b1007_microbiomics_brochure.pdf)

Mittlerweile bietet Zymo Research eine Vielzahl an Mikrobiom-Standards an – neben den technischen Kontrollen zur Optimierung des Workflows bspw. auch Spike-In Kontrollen, die nicht nur eine prozentuale Aussage über die relative Zusammensetzung der Mikroorganismen erlauben, sondern eine absolute Quantifizierung der Mikroben in einer Probe ermöglichen.

Das Darmmikrobiom als stärkstes Forschungsgebiet auf dem Gebiet der Mikrobiomik

Das Darmmikrobiom – insbesondere das des Menschen – gehört zu den am stärksten erforschten Mikrobiomen dieser Zeit. Jeder Mensch hat eine individuelle Zusammensetzung an Mikrobiota im Darm. Diese mikrobielle Gemeinschaft entwickelt sich über den Lebenszeitraum hinweg und kann sich durch Ernährung, sowie durch äußere Einflüsse wie Stress, Schlaf, Bewegung etc. kontinuierlich verändern. Die menschlichen Mikrobiota, insbesondere die Darmmikrobiota, wurden sogar als ein "essentielles Organ" betrachtet (O’Hara et al., 2006), das etwa 150 Mal mehr Gene trägt, als im gesamten menschlichen Genom zu finden sind (Ursell et al., 2014). Im Laufe der letzten Jahre konnten einige Zusammenhänge zwischen den Darm-Mikrobiota und dem physiologischen Zustand hergestellt werden. Eine veränderte Zusammensetzung der Darmbakterien kann bspw. mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht werden (engl. IBD = inflammatory bowl disease z.B. Morbus Crohn oder Colitis Ulcerosa), sowie mit Übergewicht, Diabetes Mellitus, dem metabolischen Syndrom, Atherosklerose oder sogar einer Depression (Wang et al., 2017). Ein wichtiger Begriff ist hier die Darm-Hirn-Achse (engl. gut-brain-axis).

ZymoBIOMICS® Gut Microbiome Standard

Um gezielt die Forschung des Darmmikrobioms zu unterstützen, hat Zymo Research kürzlich einen spezifischen Standard auf den Markt gebracht. Der ZymoBIOMICS® Gut Microbiome Standard ist eine genau quantifizierte Mikrobengemeinschaft aus 18 Bakterienstämmen, 2 Pilzstämme und 1 Archaeen-Stamm, die das menschliche Darmmikrobiom imitiert. Dieser Standard fordert mehrere Aspekte eines Arbeitsablaufes in des Mikrobiom-Workflows heraus:

  • Die Lyse-Effizienz: mittelsschwer zu lysierenden, grampositiven Bakterien (z.B. Roseburia hominis) kann die Effizienz des verwendeten Lyse-Protokolls überprüft werden.
  • Die Sequenziergenauigkeit: durch Genome mit einem breiten Spektrum an GC-Gehalten wird die Genauigkeit bzw. der Abdeckungsgrad einer Sequenzierung überprüft.
  • Die Nachweisgrenze der Methodik: durch pathogene Organismen mit geringer Häufigkeit kann das Detektionslimit ermittelt werden.
  • Die taxonomische Auflösung: der Standard enthält 5 verschiedene Stämme von E. coli um die taxonomische Auflösung zu ermitteln.

Diese Prüfparameter können genutzt werden, um Artefakte oder Fehler (Bias) in den Protokollen für die Mikrobiomik und Metagenomik aufzudecken.

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Abbildung 3: Die mikrobielle Zusammensetzung des Standards wurde mittels Illumina® Shotgun-Sequenzierung bestätigt und mit der definierten theoretischen Zusammensetzung verglichen. Genomische DNA wurde mit dem ZymoBIOMIC®DNA Miniprep extrahiert. Die Vorbereitung der Library wurde nach einem internen Protokoll durchgeführt. Die Shotgun-Sequenzierung wurde mit Illumina HiSeq oder MiSeq durchgeführt. Die mikrobielle Abundanz wurde auf der Grundlage der Anzahl der reads geschätzt, die gegen Referenzgenome der Organismen abgebildet wurden.
(https://files.zymoresearch.com/protocols/_d6331_zymobiomics_gut_microbiome_standard.pdf)

The Microbiomics Standards and Controls Initiative (M-SCI)

Zymo Research legt großen Wert auf die Qualität der Daten und deren Reproduzierbarkeit. Um Wissenschaftler in diesem hoch komplexen Gebiet unterstützen zu können, hat Zymo Research die Microbiomics Standard and Controls Initiative (M-SCI) ins Leben gerufen. Diese Initiative dient dazu, die ZymoBIOMICS Microbial Standards und Spike-in-Kontrollen den Wissenschaftlern kostenlos zur Verfügung zu stellen.

Quellen:

Publikationen
1) Sinha, R., Abu-Ali, G., Vogtmann, E. et al.Assessment of variation in microbial community amplicon sequencing by the Microbiome Quality Control (MBQC) project consortium.Nat Biotechnol35, 1077–1086 (2017).
https://doi.org/10.1038/nbt.3981
2) Costea, P., Zeller, G., Sunagawa, S. et al.Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies.Nat Biotechnol35, 1069–1076 (2017).
https://doi.org/10.1038/nbt.3960
3) Stulberg, E., Fravel, D., Proctor, L. et al.An assessment of US microbiome research.Nat Microbiol1, 15015 (2016).
https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2015.15
4) Marx, V. Controls let genomics experimenters drive with a dashboard.Nat Methods16, 29–32 (2019).
https://doi.org/10.1038/s41592-018-0265-y
5) Dove, A., MICROBIOMICS: The Germ Theory of Everything.American Association for the Advancement of ScienceVol.340, Issue 6133, 763-765 (2013).
https://doi.org/10.1126/science.340.6133.763
6) O’Hara A.M., Shanahan F., The gut flora as a forgotten organ.EMBO Reports7, 688-693 (2006).
https://doi.org/10.1038/sj.embor.7400731
7) Ursell L.K. et al., The Intestinal Metabolome: An Intersection Between Microbiota and Host.GastroenterologyVol. 146, Issue 6, 1470-1476 (2014).
https://doi.org/10.1053/j.gastro.2014.03.001
8) Wang B. et al., The Human Microbiota in Health and Disease.Engineering3, 71-82 (2017).
https://doi.org/10.1016/J.ENG.2017.01.008

Literatur
9) Zymo Research Broschüre: A Complete Microbiomics Solution – Unbiased from the Beginning (2019)
10) Zymo Research Broschüre: Peanuts – A Biotechnical Newsletter, Microbiomics Special Edition



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Letzte Änderungen: 22.06.2020


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