Bei der Isolierung von RNA mit den gängigen Kits steckt der Teufel im Detail.
„Welches sind die besten Kits für die RNA-Extraktion?“ Diese Frage stellte eine Forscherin von der südafrikanischen Cape Town University vor einiger Zeit auf dem Wissenschaftsportal „ResearchGate“ und löste damit eine wahre Antwortlawine aus. 333 ResearchGate-Nutzer haben der Südafrikanerin bisher geantwortet und ihre Favoriten gepostet. Sven Dittmann, wissenschaftlicher Mitarbeiter in der Abteilung Herzgenetik am Universitätsklinikum Münster, schlägt in seiner Rückmeldung auf den Thread deshalb scherzhaft vor, die ResearchGate-Gemeinde solle die Antworten statistisch auswerten und publizieren.
So abwegig ist dieser Gedanke gar nicht, man müsste die Frage der Südafrikanerin dazu nur um ein wichtiges Detail ergänzen: Aus welchem Organismus beziehungsweise aus welcher Quelle will sie die RNA isolieren? Das Paper würde sich dann nahtlos in die zahllosen RNA-Extraktionsvergleichs-Paper einreihen die untersuchen, welche Kits die beste RNA aus dem jeweiligen Organismus liefern.
Mit diesen Veröffentlichungen steigt man sicher nicht in den Olymp der molekularbiologischen Literatur auf, man sollte sie aber auch nicht als belanglose Produkt- oder Methodenartikel abtun. Bei vielen RNA-basierten Techniken, etwa der RNA-Sequenzierung (RNA-Seq), hängt das Endergebnis entscheidend von der Qualität und Beschaffenheit der eingesetzten RNA ab. Es macht hier als durchaus Sinn, die angebotenen Kits zu testen und zu vergleichen.
Wer RNA aus Organismen isolieren muss, die wie die Elritze Pimephales promelas nicht gerade zu den Standard- oder Modellorganismen gehören, sollte testen welcher RNA-Extraktions-Kit die beste RNA liefert.
So untersuchte zum Beispiel Marie-Laure Yaspos Gruppe vom Max Planck Institut für Molekulare Genetik in Berlin, wie das RNA-Extraktionsverfahren und die Methode zur Konstruktion der RNA-Bibliothek die Resultate bei der RNA-Seq beeinflussen (Sultan et al., BMC Genomics, 2014, 15:675).
Die Berliner isolierten hierzu gesamt-RNA aus humanen HEK293 Zellen mit den beiden populärsten Extraktionsverfahren: Der Trizol-Methode, die auf der RNA-Extraktion mit saurem Phenol basiert, und der Festphasen-Extraktion an kleinen Silica-Spin-Säulen, die die meisten Kit-Hersteller favorisieren.
Mit der extrahierten RNA konstruierte die Gruppe eine RNA-Bibliothek. Hierzu verwendete sie entweder die rRNA-Depletionsmethode, bei der man ribosomale RNA entfernt, oder die polyRNA+-Technik, die auf der Anreicherung polyadenylierter RNA basiert. Anschließend sequenzierten Yaspo und Co. die hergestellten RNA-Bibliotheken und untersuchten das Verhältnis von Intron- und Exon-Abschnitten (Intron und Exon-Reads) in den gelesenen Sequenzen (Reads). Da Intron-Reads sowohl von ungespleißten Vorläufer-mRNAs (hnRNA) herrühren können als auch von langen, nicht-codierenden RNAs, wirkt sich ihre Häufigkeitsverteilung unter anderem auch auf die Interpretation von RNA-Seq-Daten bei Genexpressionsprofilen aus.
Bei RNA-Bibliotheken, die die Gruppe mit der poly (A)-Methode herstellte, spielte die vorangegangene RNA-Extraktionsmethode für die Häufigkeitsverteilung der Intron-Reads keine Rolle. Deutlich anders sah die Sache jedoch bei der rRNA-Depletionstechnik aus. Setzte die Gruppe hierzu RNA aus der Trizol-Extraktion ein, resultierten doppelt so viele Intron-Reads wie mit RNA, die über Silica-Säulen gereinigt wurde.
Die Berliner vermuten, dass die Kombination aus Trizol-Extraktion und rRNA-Depletion zu einer Anhäufung von Intron-Reads führt, die von hnRNA-Spezies aus dem Zellkern stammen. Sie raten deshalb, Zellen oder Gewebe nicht unnötig lange einer sauren Phenol-Lösung auszusetzen. So vermeidet man die Freisetzung von hnRNA aus dem Kern und die damit einhergehende ungleichmäßige Verteilung von Intron- zu Exon-Reads.
Gleich sieben RNA-Extraktions-Kits auf einmal verglich die Gruppe des amerikanischen Umwelttoxikologen James T. Oris von der Miami University in Oxford, Ohio. Oris befasst sich mit den Auswirkungen anthropogener Spurenstoffe auf Wasserorganismen; eines seiner Untersuchungsobjekte ist die Elritze Pimephales promelas, die in amerikanischen Wildgewässern zuhause ist.
Im Gegensatz zu Modellfischen wie dem Zebrafisch existieren für die Elritze keine Erfahrungswerte zur Eignung einzelner Kits für die RNA-Extraktion. Die amerikanische Gruppe isolierte deshalb gesamt RNA aus Blut, Milz, Nieren, Embryos und Larven des Fisches mit den sieben verschiedenen Kits und verglich die Qualität und die Quantität der gewonnen RNA. Sämtliche Kits lieferten (mit Ausnahme des Embryogewebes) schon mit weniger als 15 Milligramm Gewebe mehr als fünf Mikrogramm gesamt-RNA, die für nachgelagerte Experimente, etwa qPCR, NGS oder Micrarray-Analysen, locker ausreichen.
Die Reinheit der gewonnen RNA ermittelte die Gruppe über das Verhältnis der Absorption bei 260 nm und 280 nm mit einem Photometer. Auch hier gab es zwischen den getesteten Kits praktisch keine Unterschiede, die A260:A280-Werte lagen durchweg über dem kritischen Schwellenwert von 1,8.
Die gewonnene RNA sollte aber nicht nur frei von Verunreinigungen sein. Genauso wichtig ist, dass sie während der Extraktion nicht in Bruchstücke zerfällt und ihre Integrität erhalten bleibt. Auskunft hierüber gibt die RNA-Integritätszahl oder RIN, die Oris‘ Gruppe mit einem Bioanalyzer ermittelte. Für qPCR-Experimente strebt man Werte über fünf, für Microarray- und NGS-Analysen über sieben an. Hier traten signifikante Unterschiede zwischen den sieben getesteten Kits zu Tage: Etwa die Hälfte lieferte RNA mit RIN-Werten, die unter den Schwellenwerten von fünf beziehungsweise sieben lagen.
Diese Ergebnisse bestätigen, was viele ResearchGate-Follower auf die Frage der südafrikanischen Wissenschaftlerin antworteten: Die Eignung eines RNA-Extraktions-Kits für ein Experiment hängt im Wesentlichen davon ab, was man mit der isolierten RNA vorhat. Und wer genau wissen will, welcher Kit hierfür am geeignetsten ist, kommt nicht darum herum, die angebotenen Kits zu vergleichen.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 04/2015, Stand: März 2015, alle Angaben ohne Gewähr)
