Die meisten machen sich nicht allzu viele Gedanken über die Art und Herkunft der Plastikmaterialien, die sie bei der PCR einsetzen. Das kann sich mitunter rächen.
Plastikabfall eines einzigen Tages in einem molekularbiologischen Labor.
Obwohl nur ein verschwindend kleiner Teil der weltweiten Plastikproduktion von mehr als 200 Millionen Tonnen jährlich in biowissenschaftlichen Laboren landet, sind auch hier Verbrauchsmaterialien aus Kunststoff allgegenwärtig. Insbesondere in molekularbiologischen Laboren, in denen PCR und qPCR-Läufe zur täglichen (Hochdurchsatz)-Routine gehören, sind die Regale und Schränke vollgestopft mit Einmal-Artikeln aus Plastik. Sieht man einmal von den Glaskapillaren für den LightCycler ab, gibt es praktisch keine Alternativen zu den für die PCR und qPCR benötigten PCR-Reaktionsgefäßen (Mikroröhrchen, Tubes), PCR-Streifen, PCR-Mikroplatten sowie Abdeckfolien und- matten aus transparentem oder gefärbtem Kunststoff.
Im Gegensatz zur Zellkultur, in der Polystyrol und Polyethylen bei Wegwerfartikeln dominieren, ist Polypropylen (PP) der meistverwendete Kunststoff für PCR-Verbrauchsmaterialien. Ein Hauptgrund hierfür ist seine hohe Temperaturbeständigkeit. Polypropylen übersteht problemlos Temperaturen von -196 °C bis + 120 °C, bei denen Polystyrol, das nur zwischen -20 °C und + 60 °C stabil ist, längst zerbröseln oder schmelzen würde. Darüber hinaus ist PP widerstandsfähig gegenüber organischen Lösungsmitteln und auch mechanisch stabil. Da es zudem nicht allzu sehr dazu neigt, Biomoleküle, etwa Nukleinsäuren oder Proteine, zu binden, ist es wie geschaffen für die Herstellung von PCR-Einmalartikeln.
Dies gilt jedoch nur unter der Vorraussetzung, dass bei der Auswahl des Polypropylen-Rohmaterials und dessen Weiterverarbeitung nicht geschlampt oder getrickst wird. Mittlerweile ist es Usus, für die Produktion von PCR-Verbrauchsmaterialien, insbesondere Reaktionsgefäßen, nur frisch produziertes, „jungfräuliches“ Polypropylen einzusetzen. Recyceltes PP ist hierfür ungeeignet.
Wie in der Halbleiterindustrie erfolgt die Produktion in Reinräumen, um die Kontamination mit Partikeln aus der Luft zu minimieren. Der bloße Hinweis der Hersteller, die PCR-Verbrauchsmaterialien in Reinräumen zu fertigen, bedeutet jedoch nicht all zuviel. Wie bei Sicherheitswerkbänken existieren auch bei Reinräumen verschiedene Klassifizierungen, die Rückschlüsse über die zulässige Partikelzahl pro Kubikmeter Luft liefern.
In den Beipackzetteln der Verbrauchsmaterialien ist zum Beispiel häufig zu lesen, dass diese in Reinräumen der Iso-Klasse 7 oder 8 hergestellt wurden. In diesen Räumen sind 107 beziehungsweise 108 Partikel mit einer Größe von mehr als 0,1 Mikrometern pro Kubikmeter Luft zulässig. Je größer die Partikel, desto weniger dürfen in der Luft enthalten sein. In Klasse 7-Reinräumen zum Beispiel 352.000 0,5 mikrometergroße Teilchen pro Kubikmeter Luft, in Klasse 8-Reinräumen 3.520.000. In Klasse 8- und 7-Reinräumen schwebt also immer noch eine ganze Menge Dreck in der Luft, der sich auf den Oberflächen der hergestellten PCR-Verbrauchsmaterialien niederschlagen kann. Im ungünstigsten Fall stören die über die Raumluft eingetragenen Partikel die PCR-Reaktionen oder verfälschen Mess-Ergebnisse.
Viele Hersteller produzieren deshalb sensible PCR-Einmalartikel, etwa für die In-vitro Diagnostik in Klasse 5 oder noch besser (aber seltener praktiziert) in Klasse 4 Reinräumen mit nur noch 100.000 beziehungsweise 10.000 0,1 µm-Partikeln je Kubikmeter Raumluft. Wer sehr empfindliche PCR- oder qPCR-Experimente plant, sollte deshalb bei seinem Lieferanten nachfragen, unter welchen Reinraumbedingungen die Plastik-Artikel produziert wurden.
Der dritte Knackpunkt, der für die Qualität und Reinheit der produzierten PCR-Verbrauchsmaterialien entscheidend ist, ist der Zusatz von Hilfsmitteln und Additiven während der Produktion der PCR-Plastikmaterialien. Diese dienen im Wesentlichen nur dazu, die Produktionskosten zu senken. Problematisch sind insbesondere Weichmacher sowie Gleit- und Desinfektionsmittel. Weichmacher, wie zum Beispiel Phtalate und die als Gleit- und Formtrennmittel eingesetzten Fettsäuren und Erucasäureamide, erlauben die Produktion der Polypropylenformteile bei niedrigeren Prozesstemperaturen sowie in weniger präzis gefertigten Spritzgusswerkzeugen und -formen.
Bei den riesigen Stückzahlen, die auf den Anlagen produziert werden, verschafft der Einsatz von Additiven den Herstellern, einen deutlichen Preisvorteil gegenüber Mitkonkurrenten. Für die Käufer von PCR-Einmalartikeln, die mit Hilfe von Zusätzen hergestellt wurden, steigt jedoch auch das Risiko, dass Rückstände der zugesetzten Substanzen die Ergebnisse der PCR verfälschen.
Diese Gefahr sollte man nicht unterschätzen. So berichtete zum Beispiel die Gruppe des Amin-Oxidasen-Spezialisten Andrew Holt von der Universität Alberta in Kanada bereits 2008 in einem Science-Paper, dass Substanzen aus Plastikreaktionsgefäßen austraten. Diese sogenannten Leachables inhibierten die untersuchten Amin-Oxidasen und ruinierten die Enzym-Assays der Gruppe (McDonald et al., Science, Vol 322, 917).
Holts Team identifizierte schließlich eine aus dem Plastik austretende quartäre Ammoniumverbindung, die während der Produktion häufig als Desinfektionsmittel eingesetzt wird, sowie das Gleitmittel Oleamid, als Amin-Oxidase-Inhibitoren. Bei ihrer weiteren Suche nach Leachables in Plastikverbrauchsmaterialien wurden die Kanadier auch bei Pipettenspitzen fündig, die Stearinsäure und Erucasäureamid in den Spitzeninhalt entließen.
Gary Bealls Gruppe an der Texas State University in San Marcos, USA, machte bei Sedimentationsversuchen von DNA mit Tonverbindungen ebenfalls Bekanntschaft mit Leachables. Im Verlauf ihrer Experimente fiel dem Team auf, dass die UV-Absorption (260 nm) in Zentrifugenröhrchen aus Plastik anstieg, wenn diese längere Zeit zentrifugiert wurden und sich dabei erwärmten.
Um der Ursache hierfür auf den Grund zu gehen, besorgten sich die Texaner Plastikzentrifugenröhrchen verschiedener Hersteller und füllten diese mit 1 ml Wasser. Anschließend maßen sie die UV-Absorption in den Tubes vor und nach 30-minütigem Erhitzen auf 100 °C (Lewis et al., BioTechniques 2010, 48, 297-302).
Die Ergebnisse dieser Versuche waren nicht besonders schmeichelhaft für die Hersteller von Plastikröhrchen. Bei den meisten tauchten in den erhitzen Tubes zwei neue Absorptionspeaks bei etwa 220 und 260 Nanometern auf. In der Regel dominierte der Peak bei 220 nm (Typ 1 Spektrum). Tubes mit stärkerem Signal bei 260 nm (Typ 2 Spektrum) waren seltener. Alarmierend waren jedoch beide Befunde. Dies umso mehr, da die Konzentration von Nukleinsäuren routinemäßig in Spektrophotometern über die Absorption bei 260 nm bestimmt wird.
Entsprechende Konzentrations-Bestimmungen der Gruppe von Einzelstrang-DNA führten in den erhitzten Tubes denn auch zu deutlich überhöhten Werten. So lag die gemessene DNA-Konzentration in den Typ 2 Tubes etwa um einen Faktor vier über den tatsächlichen Werten. Nicht viel besser sah es bei PCR-Röhrchen aus. Auch hier fanden Bealls Mitarbeiter zwei zusätzliche Absorptionspeaks, wenn sie die Röhrchen in einem Standard-PCR-Programm mit 30 Zyklen einsetzten. Als mögliche Verursacher der zusätzlichen Absorptionsbanden identifizierte die Gruppe mit Hilfe der GC-Massenspektrometrie (GC-MS) die Leachables 2,4-Dimethylbenzaldehyd oder 2-Ethylbenzaldehyd.
Zumindest Premium-Hersteller haben inzwischen auf diese Berichte reagiert und verzichten so weit als möglich, auf den Zusatz von Hilfsstoffen und Additiven bei der Produktion von PCR-Einmalartikeln. Wie ein aktuelles Paper von Nigel Birchs Gruppe von der Universität in Auckland, Neuseeland, zeigt, sollte man dennoch die Augen offen halten (Lee et al., J. Neurochem, 133, 55-65).
Nachdem Birchs Gruppe 2012 ein Paper zur Regulation der morphologischen Entwicklung von Hippocampus-Neuronen durch Neuroserpin zurückziehen musste, ging sie der Ursache der falschen Daten auf den Grund. Hierbei stellte sich heraus, dass die beobachteten Veränderungen der Neuronen auf Leachables zurückzuführen waren, die aus den medizinischen Plastikspritzen und Spritzenfiltern austraten, die die Gruppe für das Sterilfiltrieren der Medien verwendet hatte.
Bei der weiteren Suche nach dem genauen Verursacher der Effekte auf die Neuronen mittels GC-MS stieß Birchs Team auf einen regelrechten Substanz-Cocktail, den die Spritzen und Filter absonderten. Welche davon die Veränderungen der Neuronen verursachte, blieb jedoch im Dunklen. Birchs Gruppe vermutet, dass es ein unbekannter Weichmacher mit hormonartiger Wirkung gewesen sein könnte.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 09/2015, Stand: August 2015, alle Angaben ohne Gewähr)
