Eine CD als optisches Gitter (die Scheibe im linken Eck des Gehäuses), eine Webcam als Detektor und ein bisschen Elektronik: fertig ist das selbstgebaute Spektrophotometer
Das Spektrophotometer gehört seit 75 Jahren zum Grundinventar biowissenschaftlicher Labore. Daran wird sich auch so schnell nichts ändern.
Bruce Merrifield, Erfinder der Festphasen-Proteinsynthese und Nobelpreisträger von 1984, bezeichnete das UV-VIS-Spektrophotometer einst als „wahrscheinlich wichtigstes Instrument für den Fortschritt der Biowissenschaften, das jemals entwickelt wurde“.
Konstruiert wurde das erste brauchbare Spektrophotometer (Spektralphotometer) Anfang der vierziger Jahre von dem amerikanischen Chemiker Arnold Orville Beckman und seinen Kollegen von den National Technical Laboratories. Trotz der vielen eindrucksvollen Hi-Tech-Geräte, die seither die Labors eroberten, hat Merrifields Hommage an das Spektrophotometer bis heute nichts von ihrer Gültigkeit verloren. Denn auch in Zeiten von Big Data und automatisierten Laborabläufen ist das gute alte Spektrophotometer noch immer unentbehrlich, um zum Beispiel Protein- und Nukleinsäurekonzentrationen zu ermitteln, Enzymkinetiken aufzudröseln oder Moleküle sowie Ionen photometrisch zu bestimmen.
Natürlich sehen moderne Spektrophotometer schicker aus als Beckmans legendärer Prototyp mit der Bezeichnung Model D, der nicht viel mehr war als ein schwarzer, rechteckiger Kasten. Auch ihr Innenleben wurde über die Jahre kontinuierlich verfeinert und optimiert. Sie basieren aber noch immer auf Beckmans genauso bahnbrechendem wie einfachem Spektrophotometer-Konzept.
Wie schon der Name verrät, zerlegt ein Spektrophotometer das Licht einer Lampe in seine Spektralfarben und misst mit einer Photoröhre (Photomultiplier) die Intensität der einfarbigen Lichtwellen, vor und nach der Passage durch die Testsubstanz. Da die monochromatischen Lichtstrahlen auf ihrem Weg durch die Probe umso stärker absorbiert werden je konzentrierter diese ist, lässt sich die Konzentration der Probe auf einfache Weise ermitteln.
Beckman verbaute in seinem Modell D, das später in Modell DU umfirmiert und bis 1976 gebaut wurde, eine Wolframlampe als Strahlungsquelle für das sichtbare Lichtspektrum. In heutigen Instrumenten wird diese häufig durch eine Wolfram-Halogenlampe ersetzt, die im Gegensatz zu Wolframlampen auch zwischen 320 und 380 Nanometern eine ausreichende Lichtintensität liefert. Das UV-Spektrum zwischen knapp 200 und 400 Nanometern deckt in der Regel eine Deuteriumlampe ab.
Immer häufiger tauchen in Spektrophotometern auch langlebige Xenon-Blitzlampen auf, die intensive Lichtpulse im gesamten UV-VIS- sowie Nahinfrarot-Spektrum von 190 bis 1100 Nanometer abstrahlen. Das Blitzlichtgewitter der Xenon-Lampen führt jedoch zu einem erhöhten Streulicht, das empfindliche Messungen stören kann.
Auf dem Weg in Richtung Probe trifft das ungeordnete Licht der Lampe zunächst auf den Eintrittsspalt des Monochromators, dessen Breite von wenigen Mikrometern bis zu einigen Millimetern variabel einstellbar ist. Der Spalt fokussiert das Lichtbündel auf das Herzstück des Monochromators: ein Prisma, oder in neueren Modellen oftmals ein optisches Gitter, das den Lichtstrahl in seine Spektralfarben zerlegt. Ein Kondensor sammelt die aufgetrennten Lichtstrahlen und lenkt sie über einen Spiegel in den Austritts-Spalt.
Die Spaltbreite wirkt sich unmittelbar auf die Auflösung des Spektrophotometers aus: je enger er ist, desto besser kann das Spektrophotometer benachbarte Absorptionsbanden auseinanderhalten. Die Heisenbergsche Unschärferelation kann aber auch die cleverste Spektrophotometer-Optik nicht austricksen.
Die hohe Auflösung durch eine minimale Spaltbreite erkauft man sich mit einem schwächeren Signal, das wiederum zu einem schlechteren Signal-Rausch-Verhältnis führt. Da Biowissenschaftler, im Gegensatz zu Chemikern und Pharmazeuten, in der Regel nicht an den Feinheiten von Molekülspektren interessiert sind, nehmen sie es mit der Breite des Austrittspalts jedoch nicht ganz so eng. Für ihre Messungen reichen zumeist großzügige Spaltbreiten von einigen Nanometern.
Der Austrittspalt lässt nur einen winzigen Ausschnitt des Lichtspektrums passieren und lenkt diesen auf eine Glas- oder Quarzküvette, in der sich die Probe befindet. Mit dieser starren Anordnung würde jedoch immer nur eine einzige Bandbreite auf die Probe treffen. Um ein vollständiges Molekülspektrum zu erhalten, muss sich entweder der Austrittspalt durch das Lichtspektrum bewegen oder das Lichtspektrum über den Spalt. Aus technischen Gründen entschieden sich die Konstrukteure von Spektrophotometern für die zweite Variante. Sie lösten das Problem durch eine Rotationsbewegung des Prismas. Hierdurch wandert das gesamte Lichtspektrum in winzigen Nanometer-Schritten über den Austrittsspalt und fällt anschließend auf die Probe.
Nach dem Durchtritt durch die Probe erreicht der verbliebene Lichtstrahl den Detektor. Beckman verwendete noch Vakuum-Photoröhren aus Cäsiumoxid als Signalempfänger, die das Lichtsignal in eine elektrische Spannung umwandelten. Aus den Photoröhren wurden inzwischen Photomultiplier-Röhren (PMT). Diese sind jedoch nichts anderes als aufgepeppte Photoröhren, die das elektrische Signal mit Hilfe eines eingebauten Verstärkers über eine Elektronenkaskade vervielfältigen.
Neben PMTs finden sich in modernen Geräten auch zunehmend Photodioden, die im Gegensatz zu PMTs mit Niederspannung arbeiten und keine zusätzliche Stromversorgung benötigen. Ordnet man mehrere hundert oder sogar einige tausend Photodioden in einer Reihe oder einem Gitter an, erhält man einen Diodenarray. Da dieser sämtliche Wellenlängen auf einmal registriert, entsteht in wenigen Millisekunden ein vollständiges Molekülspektrum.
Diodenarrays bilden die Grundlage für Polychromator- oder Photodioden-(PDA) Spektrophotometer, die in den achtziger Jahren von Ingenieuren der Firma Hewlett-Packard entwickelt wurden. Bei diesen ist die Probenküvette im Gegensatz zu Monochromatorsystemen vor dem Prisma angeordnet. Erst nach dem Durchtritt durch die Probe wird der Lichtstrahl in seine Spektralfarben zerlegt und auf ein Diodenarray gelenkt, das alle Wellenlängen gleichzeitig erfasst. Ein angeschlossener Computer berechnet aus der Stärke der einzelnen elektrischen Signale des Diodenarrays schließlich ein Molekülspektrum.
Die Aufnahme eines Spektrums dauert mit einem PDA-Spektrophotometer nur Bruchteile von Sekunden und ist damit erheblich schneller als mit einem konventionellen Monochromator-Gerät. Das ist jedoch nicht der einzige Vorteil. Da PDA-Geräte praktisch ohne mechanische Teile auskommen, ist die Reproduzierbarkeit der Spektren deutlich höher als bei klassischen Spektrophotometern, deren Prismen oder Gitter während eines Scans mit Schrittmotoren bewegt werden müssen. Darüber hinaus minimiert die umgekehrte optische Anordnung in PDA-Spektrophotometern Streulichteffekte.
Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz ist die Strahlungsabsorption in einem Spektrophotometer proportional zur Schichtdicke (Pfadlänge) der Probe. Die Empfindlichkeit des Spektrophotometers nimmt somit mit größerer Pfadlänge zu. In Standardgeräten ist die Schichtdicke jedoch durch die Breite der Küvetten begrenzt und beträgt häufig nur einen Zentimeter.
Setzt man statt Küvetten sogenannte Flüssige Waveguide-Kapillaren (LWC) ein, lässt sich die Schichtdicke jedoch auf mehrere Meter ausdehnen. LWC-Kapillaren funktionieren ähnlich wie Glasfaserkabel. Das Licht wird aber nicht an einer Glasfaser sondern an einer Flüssigkeitsschicht reflektiert, die durch die Kapillare strömt.
Eine besonders clevere Variante eines Waveguide-Spektrophotometers, beschrieb eine chinesische Gruppe von der Universität Dalian in den Scientific Reports (Bai et al., 5:10476 | DOI: 10.1038/srep10476). Das Herzstück des Instruments ist eine sieben Zentimeter lange Waveguide-Kapillare aus Edelstahl (MWC), deren Innenfläche glattpoliert ist. Die Probe gelangt über ein Einlassventil in die Kapillare und verlässt sie über ein Auslassventil am Ende. Als Strahlungsquelle dient eine LED-Lampe, deren Licht durch die Kapillare geleitet und nach dem Austritt aus der Kapillare von einer Photodiode eingefangen wird.
Die Chinesen leiteten zunächst eine konzentrierte Farblösung durch die Kapillare und vermaßen diese spektrophotometrisch. Wie erwartet, war die Empfindlichkeit des Spektrophotometers, entsprechend der größeren Pfadlänge, etwa siebenmal höher als bei einem Standard-Gerät mit Einzentimeter-Küvette.
Ziemlich verblüfft war die Gruppe jedoch von den Resultaten, die sie mit einer verdünnten Farblösung erhielt. In diesem Fall mass das MWC-Spektrophotometer etwa 3.000-mal empfindlicher als das Standardgerät. Der tatsächliche Weg des Lichts durch die Metall-Kapillare muss demnach erheblich länger sein als nur sieben Zentimeter. Die Gruppe vermutet, dass der Lichtstrahl von der polierten Metalloberfläche unregelmäßig reflektiert wird und hierdurch einen mehr als fünf Meter langen Zickzackweg durch die Kapillare zurücklegt.
Wie stark der Zickzackkurs des Lichts die Empfindlichkeit des Geräts verbessert, zeigen die Versuche der Gruppe mit einem chromogenen Glucose-Assay. Bei diesen konnte sie Glucosemoleküle mit dem MWC-Spektrophotometer nachweisen, die in Konzentrationen von wenigen Nanomol pro Liter in den Proben vorlagen. Die Chinesen sehen deshalb für das MWC-Spektrophotomer im klinischen Einsatz oder in der Spurenanalytik gute Chancen.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 04/2016, Stand: Februar 2016, alle Angaben ohne Gewähr)
