Jede Vertiefung dieses Glasplättchens beherbergt eine einzige Zelle, die nur wenige Pikogramm genomischer DNA enthält. Mit dem richtigen Genomamplifizierungs-Kit werden daraus in jedem Well einige Mikrogramm DNA, die für das Next Generation Sequencing locker ausreichen.
Foto: UC San Diego Jacobs School of Engineering
Für die Sequenzierung einzelner Zellen muss man die spärlichen DNA-Mengen, die sie enthalten, zunächst vervielfältigen. Aber natürlich gibt es auch für diese DNA-Vermehrung entsprechende Kits.
Eine somatische, diploide Säugerzelle enthält zwei Kopien des Genoms, die zusammen nicht viel mehr als sechs Pikogramm, also sechs Billionstel Gramm, wiegen. Aber selbst diese winzige Menge reicht aus, um das komplette Genom einer einzelnen Zelle zu sequenzieren. Möglich machen dies Genomamplifizierungs-Kits (Whole Genome Amplification-, WGA-Kits). Mit verschiedenen Tricks erzeugen diese aus ein paar Pikogramm DNA mehrere hundert Nanogramm, die zur Herstellung von DNA-Bibliotheken für das Next Generation Sequencing (NGS) ausreichen.
Für die Vervielfältigung der Einzelzell-DNA bietet sich natürlich die PCR an. So verwundert es nicht, dass etwa die Hälfte der angebotenen WGA-Kits spezielle PCR-Techniken für die Amplifikation der DNA nutzt.
Ein Klassiker ist die schon etwas in die Jahre gekommene Linker-Adapter-PCR, die aber nach wie vor tadellos funktioniert. Der Trick besteht darin, die genomische DNA zunächst mit dem Restriktionsenzym MseI in Abermillionen, etwa 100 bis 2.000 Basenpaare lange Fragmente zu zerlegen, an deren Enden im nächsten Schritt Adapter ligiert werden. In der anschließenden PCR binden universelle Primer an die Adaptersequenz und dienen als Startpunkte für die Polymerase, die im letzten Schritt die Einzelfragmente amplifiziert.
Die zweite in WGA-Kits häufig anzutreffende PCR-Strategie ist die sogenannte PCR mit degenerierten Oligonukleotid-Primern oder kurz DOP-PCR, die ebenfalls schon einige Jährchen auf dem Buckel hat. DOP-PCR-Primer enthalten eine kurze Ankersequenz mit sechs Basen am 3‘-Ende, ein Mittelteil aus sechs zufälligen Basen sowie einen weiteren Anker am 5‘-Ende. Mit den Primern führt man zunächst ein paar PCR-Runden bei relativ niedriger Temperatur durch. Bei diesen laxen Bedingungen binden die 3‘-Anker an zahllosen, über das gesamte Genom verteilten Positionen an die genomische DNA. Die Polymerase verlängert die Primer und erzeugt hierdurch DNA-Fragmente mit den entsprechenden Primern an den 3‘- und 5‘-Enden, die schließlich in einer etwas „strengeren“ PCR mit hoher Annealing-Temperatur amplifiziert werden. Die erhöhte Temperatur stellt sicher, dass nur exakt komplementäre DOP-Primer an ihre Pendants an den Fragment-Enden binden, wodurch die DNA-Fragmente sehr spezifisch amplifiziert werden.
Gut die Hälfte der Hersteller bevorzugt statt der PCR isothermale Amplifikationsverfahren in ihren WGA-Kits. Zu diesen zählt zum Beispiel die Multiple Displacement Amplification (MDA), die Roger Lasken vom Craig Venter Institut in den USA zu Beginn des neuen Milleniums einführte. Auch die MDA basiert auf Primern mit Zufallssequenzen, im Gegensatz zur DOP-PCR sind sie jedoch wesentlich kürzer und bestehen aus Hexameren.
Wie bei der DOP-PCR binden auch die Hexamere an unzähligen, über das ganze Genom verteilten Positionen. Sie werden jedoch nicht von einer klassischen PCR-Polymerase verlängert, sondern durch die Polymerase des Bakteriophagen phi29. Diese trennt doppelsträngige DNA (strand displacement) und amplifiziert die Einzelstränge bei gleichbleibender Temperatur, also isothermal. Hinzu kommt, dass sie aufgrund ihrer 3‘-5‘-Exonuklease- sowie Proofreading-Aktivität äußerst exakt arbeitet.
Stößt die phi29-Polymerase bei der Verlängerung der hexameren MDA-Primer auf ein bereits elongiertes Fragment, verdrängt sie dieses von dem Template. Sie erzeugt auf diese Weise verzweigte DNA-Stücke, an die wiederum neue Primer binden, die als weitere Startstellen dienen. Letztendlich entstehen hierdurch ausreichend viele 50 bis 100 Kilobasenpaare lange DNA-Fragmente für die Konstruktion von NGS-Bibliotheken.
Sowohl bei DOP-PCR als auch bei MDA ist die Gefahr groß, dass die Sequenz der genomischen DNA nicht gleichmäßig amplifiziert wird. Diese Schieflage (Bias) verstärkt sich durch die exponentielle Amplifikation zusätzlich, da immer neue Kopien von teilweise fehlerhaften Kopien erzeugt werden. Um dies zu verhindern, entwickelte die Gruppe des Einzelzell-Spezialisten Sunney Xie von der Harvard Universität in den USA, die sogenannte Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles-, kurz MALBAC-Technik. Diese hat den großen Vorteil, dass die genomische DNA nahezu linear amplifiziert wird.
Wie DOP-PCR und MDA basiert auch die MALBAC-Strategie auf speziellen Primern: MALBAC-Primer enthalten acht Zufallsnukleotide am 3‘-Ende sowie eine feste Sequenz aus 27 Basen am 5‘-Ende. Das MALBAC-Protokoll startet mit dem Aufschmelzen der genomischen DNA bei 94° C. Anschließend senkt man die Temperatur auf 15° C bis 20° C, wodurch die 3‘-Enden der Primer an unterschiedlichen Stellen an die genomische DNA binden. Eine Polymerase mit Strangverdrängungs-Aktivität verlängert hierauf die Primer bei 65° C.
Dann folgt der erste Kniff der MALBACTechnik: Statt die Polymerase endlos weiter werkeln zu lassen, schmilzt man die entstandenen Hybriden aus teilweise verlängerten Amplikons (Semi-Amplikons) und genomischer DNA erneut auf. Anschließend lässt man die Einzelstränge etwa ein Dutzend weitere Runden drehen, bei denen jeweils das Programm aus Abkühlen, Verlängern und Aufschmelzen abgespult wird.
Am Ende jeder Runde entstehen aus den halbfertigen Amplikons vollständige Amplikons mit homologen Primern an beiden Enden. Das ist der zweite entscheidende Trick der MALBAC-Technik: Bei 58° C pappen die Enden zusammen, wodurch schleifenförmige DNA-Stücke (Loops) entstehen, die vor der weiteren Amplifikation geschützt sind. Die ebenfalls noch enthaltenen halbfertigen Amplikons gehen zusammen mit dem Original-Template in die nächste Runde. Erst nach dieser linear verlaufenden Voramplifikation werden die entstandenen DNA-Loops mit einer konventionellen PCR amplifiziert, bei der die feste Sequenz aus 27 Basen als Primer fungiert.
Und mit welcher WGA-Technik erzielt man nun die besten Resultate? Das fragte sich auch Ehud Shapiros Gruppe vom Weizmann Institute of Science in Israel und ließ sieben gängige WGA-Kits gegeneinander antreten (bioRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/186940). In dem WGA-Duell mussten die Kits die genomische DNA einzelner humaner embryonaler Stammzellen amplifizieren. Die amplifizierte DNA setzten die Forscher für die Herstellung eines sogenannten Amplicon Panels ein, das DNA-Sequenzen gezielt für die anschließende NGS anreichert. Das Panel der Israelis enthielt etwas mehr als 3.000 Amplikons, die bei der NGS als Reads auftauchen sollten.
Der verwendete WGA-Kit musste die genomische DNA also möglichst gut abdecken (Genomic Coverage) und entsprechend gleichmäßig und exakt vervielfältigen. Bei fünf der getesteten WGA-Kits war dies auch weitgehend der Fall, bei zwei Kits war die Abdeckung jedoch grottenschlecht. Der Grad der genomischen Abdeckung war aber nur eines von verschiedenen Kriterien, mit denen die Israelis die Güte der einzelnen Kits beurteilten. Weitere waren die Reproduzierbarkeit sowie die Fehlerrate. Auch hier fanden Shapiros Mitarbeiter signifikante Unterschiede. So beobachteten sie zum Beispiel bei den MDA-basierten Kits geringere Fehlerraten, was aber nicht wirklich überrascht. Das Team empfiehlt letztlich, WGA-Kits passend zur jeweils geplanten Einzelzell-Analyse auszuwählen sowie ihre Stärken und Schwächen hierbei zu berücksichtigen.
Der Chemiker Sunney Xie von der Universität Harvard ist einer der kreativsten Entwickler neuer Genomamplifikations-Techniken.
Foto: Jon Chase/Harvard
Sunney Xies Gruppe bastelt derweil fleißig weiter an neuen WGA-Techniken, die einige der Schwächen kommerzieller WGA-Kits ausmerzen sollen. Im letzten Jahr veröffentlichte seine Mannschaft eine neue Transposon-basierte WGA-Methode, die sich Linear Amplification via Transposon Insertion, kurz LIANTI nennt (Science: 356, 189-94).
Wie der Name bereits andeutet, ist ein Transposon der Hauptakteur der LIANTI-Technik. Es besteht aus einem Haarnadel-förmigen T7-Promoter mit Bindestellen für das Enzym Transposase an beiden Enden der Schleife. Mischt man dieses LIANTI-Transposon mit der Transposase, so entsteht ein dimeres LIANTI-Transposom. Dieses zerlegt die genomische DNA in zahllose Fragmente und fügt gleichzeitig den T7-Promoter in beide Enden der DNA-Fragmente ein.
Die T7-RNA-Polymerase nutzt den T7-Promotor im nächsten Schritt als Startpunkt für das Umschreiben des DNA-Fragments in RNA. Bei diesem Prozess wird das Fragment gleichzeitig linear amplifiziert; letztendlich entstehen RNA-Fragmente mit linearisierten LIANTI-Transposons an den 3‘-Enden. Die Enden hybridisieren mit sich selbst und bilden erneut eine Haarnadelschleife.
Der Rest ist dann molekularbiologische Routine: Die RNA-Fragmente mit den Transposon-Loops werden zunächst revers transkribiert. Nach einem RNase-Verdau synthetisiert man den noch fehlenden zweiten cDNA-Strang. Und zum Abschluss versieht man die Amplikons mit einem Barcode und setzt sie für die Herstellung der NGS-Bibliothek ein.
Noch ist die LIANTI-Technik, die wesentlich exakter ist als die bestehenden WGA-Methoden, nicht in WGA-Kits angekommen. Das dürfte aber nur eine Frage der Zeit sein. Und wer weiß, was der umtriebige Sunney Xie noch alles in der Pipeline hat.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 03/2018, Stand: Februar 2018, alle Angaben ohne Gewähr)
