(08.12.2019) Mikroplatten-Reader sind nicht ganz billig, zählen aber zu den unverzichtbaren Geräten im Labor. Wer will, kann sich auch sein eigenes Instrument zusammenbauen.
Gibt es eigentlich einen zell- oder molekularbiologischen Assay, den man nicht mit einem multifunktionalen Mikroplatten-Reader (Multimode Reader) auswerten kann? Allzu viele dürften es nicht mehr sein. Und wenn die Entwicklung der Lesegeräte so weitergeht wie bisher, dann benötigt man in absehbarer Zeit im Labor nur noch einen Multimode Reader, um sämtliche nicht-radioaktiven colorimetrischen, fluorometrischen oder luminometrischen Assays auszuwerten.
Neben Absorptionsmessungen mit sichtbarem oder UV-Licht (UV/vis) und Fluoreszenz-Assays, die auch einfache Singlemode Reader beherrschen, sind Multimode Reader für viele weitere Assays geeignet. Zu diesen zählen neben Förster-Resonanz-Energie-Transfer-(FRET)-Analysen und zeitaufgelöster FRET auch Biolumineszenz-Assays inklusive dem FRET-Pendant BRET. Weitere wichtige Techniken, die zum Standardrepertoire der meisten Multimode-Geräte gehören, sind Fluoreszenz-Polarisation sowie verschiedene Alpha-Screen-Techniken.
Einige Hersteller motzen ihre Top-Geräte inzwischen mit zusätzlichen Imaging- beziehungsweise Zytometrie-Funktionen auf und wildern mit diesen in den Revieren klassischer Live-Cell-Imaging- oder High-Content-Imaging-Instrumente. Wobei es durchaus naheliegend ist, einen Multimode Reader mit einem zusätzlichen Imaging-Modul auszustatten. Dieses besteht im Wesentlichen aus ein paar LEDs, einer cMOS-Kamera, Objektiven, einem Autofokus sowie verschiedenen Farbfiltern. Komplettiert wird die bildgebende Einheit zumeist durch ein zusätzliches Umgebungs-Modul, das Temperatur, Luftfeuchtigkeit sowie CO2- und O2-Gehalt kontrolliert. Schon kann es losgehen mit typischen Live-Cell-Imaging-Anwendungen wie zum Beispiel Konfluenzmessungen, Zellvitalitäts-Tests, Zellkernzählungen oder Bestimmungen der Transfektionseffizienz.
Neben den Entwicklungsabteilungen der Reader-Hersteller sind es aber auch immer wieder Grundlagenforscher, die die Geräte mit neuen Funktionen versehen. Jüngstes Beispiel ist ein modifizierter Mikroplatten-Reader, den Elisabeth Gwinns Gruppe von der University of California in Santa Barbara im letzten Jahr vorstellte.
Gwinn ist Physikerin und forscht an kleinen Edelmetall-Clustern mit Eigenschaften, die auch für Biologen sehr interessant sind: Die aus nur wenigen Metallatomen bestehenden Metall-Ansammlungen fluoreszieren in einem weiten Farbspektrum, das von Blau bis ins nahe Infrarot (NIR) reicht. Dazu muss man sie jedoch mit kurzen DNA- oder RNA-Oligos stabilisieren, deren Sequenz zusammen mit der Anzahl der Metallatome die Fluoreszenz-Farbe vorgibt. Durch welchen Mechanismus die Nukleotid-Sequenz die emittierte Lichtfarbe mitbeeinflusst, weiß man zwar noch nicht, Gwinns Team ist aber fest entschlossen, den Farb-Code zu knacken.
Dazu synthetisierte die Gruppe 375 verschiedene Oligos mit zehn Basen und stellte mit diesen DNA-stabilisierte Silber-Cluster her (AgN-DNA, N steht für die Zahl der Silberatome). Um aus diesen möglichst schnell Kandidaten herausfischen zu können, die jenseits von 800 Nanometern im nahen Infrarot fluoreszieren, benötigte das kalifornische Team einen Mikroplatten-Reader mit NIR-Detektor. Da dieser bei den meisten kommerziellen Geräten fehlt, oder spätestens bei 1.000 Nanometern das Ende der Fahnenstange erreicht ist, rüstete Gwinns Mannschaft kurzerhand einen filterbasierten UV/vis-Fluoreszenz-Reader zum NIR-Lesegerät um.
Hierzu waren nur wenige Handgriffe nötig. Zunächst tauschte das kalifornische Team die auf sichtbares Licht ausgelegte Photomultiplier-Röhre (PMT) gegen einen Photodetektor aus, der Licht mit 800 bis 1.700 Nanometern registriert. Die ursprünglichen UV-Anregungsfilter ersetzte es mit einer Filterkombination, die Licht zwischen 280 und 340 Nanometer passieren lässt. Zu guter Letzt flog noch der Emissionsfilter heraus. Er wurde durch Bandpassfilter mit einer Auflösung von fünfzig Nanometern substituiert, die für Wellenlängen zwischen 650 und 1.400 Nanometern durchlässig sind.
Mit dem modifizierten Mikroplatten-Reader fand die Gruppe schließlich 44 AgN-DNAs, die zwischen 800 und 1.050 Nanometern fluoreszierten und sich als Proben für die Infrarot-Bildgebung in biologischen Systemen eignen könnten.
Multimode Reader, die mit allen möglichen Schikanen aufwarten, sind ganz nett – wenn man das nötige Kleingeld hat und sie auch regelmäßig nutzt. Für die Großzahl der im Labor üblichen Absorptions- oder Fluoreszenzmessungen genügt jedoch ein vergleichsweise einfach strukturierter, nicht ganz so teurer Reader, der mit einem UV/vis-Spektrometer und Fluoreszenzfiltern ausgestattet ist.
Wenn auch dafür das Geld zu knapp ist, kann man den Reader auch selbst zusammenschrauben. Die Gruppe des Bioingenieurs Brian Chow von der University of Pennsylvania veröffentlichte Anfang des Jahres die Baupläne eines Open-Source Plate Readers, der im Gegensatz zu vielen anderen Selbstbau-Readern aus der Maker-Szene mit wenigen Abstrichen auch professionellen Ansprüchen genügen müsste (Biochemistry 58: 468-73).
Chows Open-Source-Reader ist aus drei wesentlichen Baugruppen aufgebaut: Einem optischen System, das Anregungslicht in die Wells der Mikroplatte leitet und von diesen emittiertes Licht über Lichtleiter an einen CCD-Detektor überträgt; einem Schlitten als Träger für die Mikrotiterplatten, den zwei Schrittmotoren in x- und y-Richtung durch das optische System bewegen; sowie verschiedenen Leiterplatten, auf denen Mikroprozessoren und -controller untergebracht sind, die den Reader steuern. Eingebaut sind die Komponenten in ein Rahmengestell aus standardisierten Aluminiumstreben, das mit lasergeschnittenen Blechtafeln verkleidet ist.
Kostenpunkt des Ganzen: Etwas mehr als 3.000 Euro. Kein schlechter Preis, wenn man bedenkt, dass schon simple Absorptions-Reader mehr als 4.000 Euro kosten und Fluoreszenz-Reader kaum unter 10.000 Euro zu haben sind – ganz zu schweigen von Multimode Readern, die locker das Zehnfache des Open-Source-Readers kosten. Klar, für das eingesparte Geld muss man einiges an Zeit investieren. Die Teilelisten und Baupläne des Readers sind aber so umfangreich und detailliert, dass der Zusammenbau auch für Biowissenschaftler zu schaffen sein sollte. Ansonsten wäre das Gerät auch ein schönes Projekt für die Auszubildenden in der Institutswerkstatt.
Der unschlagbare Preis des Readers ist aber nur durch Kompromisse bei den verwendeten Bauteilen möglich, die sich etwas auf seine Empfindlichkeit und Präzision auswirken. So liegt zum Beispiel das Detektionslimit für einen Fluorescein-Standard bei etwa zehn Nanomol pro Liter (nM). Mehr ist mit dem eingesetzten CCD-Detektor nicht drin. Kommerzielle Geräte, die wesentlich empfindlichere aber auch viel teuere PMTs als Detektoren verwenden, weisen dagegen noch picomolare Fluorescein-Konzentrationen nach – da kann man die einzelnen Fluorescein-Moleküle, die sich in einem Well der Mikroplatte befinden, schon beinahe von Hand zählen.
Auch die eingebauten Elektromotoren, mit denen die Mikroplatten-Wells im optischen System des Open-Source-Readers platziert werden, sind nicht ganz so präzise wie die üblicherweise in kommerziellen Readern verbauten Schrittmotoren – dafür kosten sie aber auch nur ein Fünfzigstel.
Ganz auf das Wesentliche reduziert ist auch ein neuer Reader, den das Hamburger Start-up Byonoy Anfang des Jahres auf den Markt brachte: Das Gerät ist nicht viel größer als die zu lesende Mikroplatte selbst und erinnert eher an eine portable Festplatte als an einen ausgewachsenen Mikroplatten-Reader. Die grundlegende Idee für den Mini-Reader stammt von Martina Gerkens Gruppe am Lehrstuhl für Integrierte Systeme und Photonik der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Gerken arbeitet unter anderem an Biosensoren für die labelfreie Detektion von Biomolekülen, etwa Proteinen. Zu diesen gehören auch sogenannte Gittersensoren beziehungsweise Resonant Waveguide Gratings (RWG), die auf der Oberfläche spezieller Mikrotiterplatten aufgebracht sind.
Werden die Platten von unten mit einer Lichtquelle bestrahlt, wandert eine exponentiell abklingende Lichtwelle auf der Plattenoberfläche entlang. Der RWG-Sensor koppelt sich in die Welle ein und bestimmt so den Brechungsindex auf der Plattenoberfläche. Interessant ist, was passiert, wenn Zellen auf der Oberfläche der Platte wachsen: Nimmt die Zahl der Zellen zu oder ab, oder ändert sich ihre Zellmasse etwa aufgrund eines äußeren Reizes, so verändert sich auch der von den RWG-Sensoren registrierte Brechungsindex.
Auf diesem Prinzip basieren auch die von Corning entwickelten Epic-Mikrotiterplatten, die bisher aber nur mit großen und teuren Readern ausgelesen werden konnten. Gerkens ehemaliger Postdoc Yousef Nazirizadeh verkleinerte die Leseeinheit mithilfe von LEDs und Photodioden jedoch so weit, dass sie nicht mehr Platz benötigt als das Well einer Mikroplatte und sich so jedes Well separat auslesen lässt.
Nazirizadeh war vermutlich schnell klar, dass man sein geschrumpftes RWG-Detektions-System zu Geld machen kann, und so gründete er 2015 mit Gerken das Spin-off Byosens. Inzwischen wurde Byosens in Byonoy umbenannt und siedelte von Kiel nach Hamburg um.
Der Trick mit den Photodioden funktioniert aber nicht nur mit RWGs, sondern auch für simple Absorptionsmessungen. Nazirizadeh konstruierte mit seinem Team neben dem labelfreien Reader für 96-Epic-Platten einen Absorptions-Reader für 96-Well-Standardplatten. Auch bei diesem besteht die Detektions-Einheit aus jeweils einer einzigen kleinen Photodiode pro Well. Das spart Platz und macht Schrittmotoren, Photomultiplier, Plattentische und andere bewegliche Teile obsolet, die nur Strom fressen und sich auf Dauer abnutzen. Entsprechend genügt für die Stromversorgung ein Fünf-Volt-USB-Anschluss. Darüber hinaus kann man den Reader praktisch überallhin mitnehmen und an jedem beliebigen Ort, etwa in einem Inkubator, aufstellen. Wenn das keine Kampfansage an die Hersteller traditioneller Mikroplatten-Reader ist?
Mikroplatten-Reader im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 12/2019, Stand: November 2019, alle Angaben ohne Gewähr)