Für die Herstellung von Sphäroiden mit der Hanging-Drop-Technik braucht man etwas Geschick. Foto: Ana Mandujano
(08.06.2020) Immer mehr Forscher steigen auf die 3D-Zellkultur um. Ein stetig größer werdendes Arsenal von Kulturplatten und anderen Hilfsmitteln erleichtert ihnen die Arbeit.
Wer sich dazu durchgerungen hat, von der vertrauten zweidimensionalen Zellkultur auf die dreidimensionale umzusteigen, weil letztere zumindest etwas näher an den tatsächlichen Verhältnissen in einem natürlichen Gewebe dran ist, muss danach gleich die nächste Entscheidung treffen. Sollen die Zellen ohne oder mit zusätzlichem Trägergerüst (Scaffold) wachsen?
Welches der beiden grundlegenden 3D-Zellkulturmodelle man einsetzt, hängt natürlich auch von den Bedürfnissen der untersuchten Zellen ab. Weil sie relativ einfach herzustellen sind, versuchen sich viele Zellkultivierer zunächst an trägerfreien Sphäroid-Kulturen. Mit diesen experimentierten bereits die Pioniere der Zellkultur: Etwa Robert Koch, Ross Granville Harrison und Johannes Holtfreter.
Koch entwickelte schon 1880 eine Methode, mit der er Anthrax-Bazillen in kleinen Flüssigkeitstropfen züchten konnte, die an der Unterseite eines Objektträgers hingen.
Eine ähnliche Hanging-Drop-Technik verwendete Ross Harrison Anfang des Zwanzigsten Jahrhunderts, um Nervenzellen in hängenden Nährmedien-Tropfen hochzupäppeln.
Noch näher dran an dem, was man unter modernen Sphäroid-Kulturen versteht, war jedoch Johannes Holtfreter, der in den zwanziger Jahren bei Hans Spemann an der Universität Freiburg promovierte. Holtfreter studierte während seiner weiteren Forschungsstationen die Entwicklung der Gastrula am Beispiel von Amphibienembryos – zunächst in den Dreißiger Jahren am Kaiser-Wilhelm-Institut für Biologie in Berlin und nach seiner Flucht vor den Nazis an den Universitäten in Montreal, Kanada sowie Rochester, England. Um herauszufinden, welche Regionen des Amphibienembryos sich weiterentwickeln können, zerlegte sie Holtfreter in kleine Teile. In einem nach ihm benannten Medium ließ er diese anschließend in hängenden Tropfen zu Sphäroiden heranwachsen.
Das Hanging-Drop-Verfahren setzen Forscher noch immer für die 3D-Zellkultur ein, die Technik wurde aber etwas modifiziert. Statt die Zellsuspension auf die Innenseite eines Petrischalen-Deckels zu tropfen, und diesen dann umzudrehen wie zu Holtfreters Zeiten, pipettiert man die Zellen meist in spezielle Hanging-Drop-Mikroplatten mit offenen Wells ohne Boden.
Die Öffnung ist gerade so groß, dass ein kleiner Tropfen des Kulturmediums hindurch schlüpfen kann, ohne gleich zu zerplatzen, wenn die Oberflächenspannung nicht mehr ausreicht, sein Gewicht zu tragen. Bei der klassischen Hanging-Drop-Technik ist diese Grenze bereits ab fünfzig Mikrolitern erreicht, entsprechend klein sind die mit ihr zu erzielenden Sphäroide. Und man sollte für sie eine ausgesprochen ruhige Hand beim Pipettieren haben: Der in regelmäßigen Abständen fällige Medienwechsel wird ansonsten für die winzigen Zellklümpchen zur Zitterpartie.
Deutlich einfacher lassen sich Sphäroide mit magnetischen Nanopartikeln und einem Magneten erzeugen. Die Partikel pipettiert man dazu zu den Zellen in einer Kulturschale und inkubiert das Ganze ein paar Stunden. Die winzigen, inerten Minimagneten lagern sich an die Zellmembran an und magnetisieren die Zellen. Anschließend befördert man die Zellen mit einem Magneten vom Boden der Kulturschale in die Höhe und hält sie knapp unter der Oberfläche des Kulturmediums in der Schwebe.
Oft sind die Verrenkungen mit der Hanging-Drop- oder Magnetschwebe-Technik aber gar nicht nötig, um Sphäroide zu erhalten. Viele Zellen bilden diese auch auf der Oberfläche von Kulturschalen oder -platten, wenn man verhindert, dass sie sich an diese anhaften können. Dazu beschichtet man die Platten mit einer inerten Substanz wie zum Beispiel Agar, Agarose oder poly-HEMA (2-Hydroxyethylmethacrylat). Da die Zellen an diesen Molekülen keinen Halt finden, suchen sie untereinander Kontakt und formen schließlich Sphäroide oder auch unregelmäßigere Zellhaufen.
Strukturiert man die Oberflächen der Kulturgefäße beziehungsweise deren Böden entsprechend, kann man auf die Beschichtung auch ganz verzichten. Der Trick besteht darin, viele kleine kegel- oder pyramidenförmige Vertiefungen in die Platten- oder Well-Böden einzuarbeiten, die den Zellen keine ebene Flächen bieten, auf denen sie sich zweidimensional ausbreiten können. Die vielen Kanten und schrägen Flächen zwingen sie dazu, kugelförmige Sphäroide oder an die jeweilige Oberflächengeometrie angepasste Zellaggregate zu bilden, die zum Beispiel konusförmig sind.
3D-Zellkulturplatten werden von verschiedenen Herstellern angeboten, darunter auch mehrere Start-ups. In ihren Flyern und Application Notes geben diese aber meist nur die groben Züge des Herstellungsprozesses preis. Wesentlich detaillierter beschreibt eine südkoreanische Gruppe in den Scientific Reports, wie man sie günstig und schnell selbst fertigen kann (9: 13976).
Nein, nicht mit einem 3D-Drucker, sondern ganz altmodisch mit einer computergesteuerten (CNC) Fräsmaschine, die die Designvorgaben eines CAD-Programms ausführt. CNC-Fräsmaschinen stehen zwar nicht gerade im Labor herum, aber mit ziemlicher Sicherheit in der institutseigenen Werkstatt. Man benötigt sie auch nur einmal, um die festgelegte Oberflächenstruktur aus einem Aluminiumblock herauszufräsen, der für den späteren Guss als Negativform dient.
Die Topographie der bearbeiteten Oberfläche erinnert ein bisschen an die regelmäßig angeordneten Höcker eines Eierkartons, die Höcker und Vertiefungen sind jedoch fließend weich abgerundet und exakt symmetrisch. In die Aluform gießt man den Kunststoff Polydimethylsiloxan (PDMS) und erhält, nachdem dieser erstarrt ist, eine 3D-Zellkulturplatte mit der entsprechenden Oberflächenstruktur.
Die Eignung der Höcker-Platte für die 3D-Kultur testeten die Südkoreaner mit mesenchymalen Stammzellen, die sie darauf kultivierten. Nach einer Stunde sah es zunächst so aus, als würden sich die Zellen über die gesamte Oberfläche ausbreiten. Doch schon einen Tag später war klar, dass sie sich in der Mitte der Vertiefungen sammelten und kleine Sphäroide ausbildeten.
Die kugelförmigen Zellhaufen, die man mit den oben genannten Techniken herstellen kann, sind für viele Untersuchungen ein deutlich besseres Modell als zweidimensionale Zellkulturen – etwa für die Wirkstoffanalyse in Tumor- oder Nervenzellen.
Für das Tissue Engineering, bei dem die Zellen die charakteristische Form und Struktur eines Gewebetyps, etwa eines Gefäßes, nachbilden sollen, sind Sphäroide aber kaum geeignet. Hier siedelt man die Zellen häufig auf einem Scaffold an, das die Funktion der extrazellulären Matrix (ECM) nachahmt beziehungsweise übernimmt. Die extrazelluläre Matrix fungiert in Geweben als Stütze für die Zellen, sie steuert aber auch etliche vitale Prozesse des Zellverbandes – etwa Differenzierung, Migration sowie Morphologie. Hauptkomponenten der ECM sind neben Proteoglykanen insbesondere Faserproteine wie Kollagen, Fibronektin, Tenascin, Elastin und Laminin.
3D-Zellkultivierer verwenden deshalb meist Materialien für ihre Scaffolds, die von ähnlichen Faserstrukturen durchzogen sind. Zu ihren Favoriten zählen Hydrogele aus quervernetzten Polymeren, die sehr viel Wasser einlagern können und hierdurch eine flexible und dennoch straffe, netzartige Struktur aufweisen. In dieser fühlen sich die kultivierten Zellen fast genauso wohl wie in einem natürlichen Gewebe.
Die für weiche Scaffolds verwendeten Hydrogele stammen häufig aus natürlichen Quellen etwa Kollagen, Fibrin oder MatriGel, das aus einer solubilisierten Basalmembran-Präparation des Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkoms gewonnen wird. Manche Forscher ziehen es aber auch vor, sie aus natürlichen oder künstlichen Polymeren selbst herzustellen, um ihre mechanischen und physiologischen Eigenschaften möglichst genau an die Bedürfnisse der kultivierten Zellen anpassen zu können.
Ziemlich experimentierfreudig sind 3D-Zellkultivierer bei der Konstruktion harter Scaffolds, die kultivierten Knochen-, Knorpel-, Haut- oder Muskelzellen eine klar umrissene, geometrische Struktur vorgeben, die sie besiedeln beziehungsweise ausfüllen sollen. Schon die üblichen Herstellungstechniken sind ziemlich exotisch. So wird etwa beim sogenannten Elektrospinning-Verfahren eine positiv geladene Polymerlösung durch eine feine Düse gepresst. Ein negativ geladener Kollektor sammelt den hauchdünnen Faden ein, wodurch dieser ein feines Gespinst bildet, das als Scaffold-Rohling dient, der mit zusätzlichen chemischen Gruppen funktionalisiert werden kann.
Fast zu hundert Prozent aus Luft besteht sogenanntes Aerographit, das Christine Selhuber-Unkels Gruppe von der Universität Kiel für den Bau eines High-Tech-Scaffolds einsetzte (ACS Appl. Mater. Interfaces 8: 14980-85). Dieses pechschwarze, elektrisch leitfähige Nanomaterial besteht aus einem feinen Gespinst von 0,5 bis drei Mikrometer dicken Kohlenstofffasern, die ähnlich wie die extrazelluläre Matrix zehn bis hundert Mikrometer große Poren bilden.
An der extrem hydrophoben Oberfläche von Aerographit perlt Wasser jedoch ab, ohne sie zu benetzen. Die Gruppe musste sich also etwas einfallen lassen, um das Material für die 3D-Zellkultur verwenden zu können. Sie überzog die Oberfläche mit einer Beschichtung aus Polyethylenglykol (PEG)-Lipidketten, die jeweils mit endständigen Amin-Gruppen funktionalisiert waren. Die hydrophoben Alkylreste der Lipidketten lagern sich an die Oberfläche des Aerographits an, während der hydrophile Polyethylenglykol-Abschnitt die Benetzung mit Wasser vermittelt. An die Amin-Gruppe koppelten die Kieler schließlich ein zyklisches Peptid, das Fibroblast-Integrinen als Ligand dient. Danach konnten sie mit der Besiedelung des modifizierten Aerographit-Scaffolds mit embryonalen Fibroblasten von Ratten loslegen. Die Zellen drangen tatsächlich in das feine Netzwerk der Graphitfasern ein und wuchsen darin zu einer dreidimensionalen Struktur heran.
Noch sucht man Aerographit bei den kommerziellen Herstellern von Scaffolds oder Hydrogelen vergebens. Die Auswahl an angebotenem Zubehör und Material für die 3D-Zellkultur ist aber auch ohne dieses äußerst umfangreich. Mithilfe der Tabelle auf den nächsten Seiten können Sie sich einen Überblick verschaffen.
3D-Zellkultur im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 6/2020, Stand: Mai 2020, alle Angaben ohne Gewähr)