In akademischen Forschungslaboren werden Antikörper häufig mit Affinitätssäulen gereinigt. Foto: University of Florida
(01.09.2020) Antikörperreinigungs-Kits basieren meist auf kleinen Spinsäulen oder Kügelchen, die mit Protein A oder G bestückt sind. Eine interessante chromatographiefreie Alternative entwickelte eine israelische Gruppe.
Was wäre die moderne biowissenschaftliche Forschung ohne polyklonale (pAb) oder monoklonale Antikörper (mAb)? Allzu viel würde von ihr nicht mehr übrigbleiben, sieht man vielleicht mal von der ebenfalls omnipräsenten PCR ab. Kaum ein Versuch oder Assay, bei dem die kleinen Helferlein nicht mit von der Partie sind und den Forschern das Leben erleichtern oder ihre Experimente erst ermöglichen. Antikörper sind aber nicht nur in der Grundlagenforschung unverzichtbar für unzählige Methoden und Protokolle, die von Immunoassays, Western Blots, ELISAs und Immunhistochemie über Mikroskopie und Bildgebung bis hin zur Durchflusszytometrie reichen. Sie sind auch wichtige Werkzeuge in der klinischen Diagnostik und werden zunehmend als Wirkstoffe beziehungsweise therapeutische Antikörper für die Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt.
Eine der wichtigsten Quellen für polyklonale Antikörper beziehungsweise Immunglobuline (Ig) ist das Blutplasma von Säugetieren. Auf das Gewicht bezogen sind etwa zwanzig Prozent der darin enthaltenen Proteine Antikörper, die in fünf verschiedene Klassen eingeteilt werden: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Die ersten drei spielen zwar auch wichtige Rollen innerhalb des Immunsystems, für Forschungszwecke werden aber meist IgGs und IgMs verwendet. IgMs tauchen bereits in der frühen Phase der primären Immunantwort auf ein Antigen auf, während IgGs in der darauf folgenden sekundären Immunantwort in großen Mengen synthetisiert werden.
Forscher machen sich dies zunutze, indem sie Kaninchen, Ziegen, Schafen oder anderen Säugern ein Antigen injizieren und danach in der Regel die während der Immunantwort gebildeten IgGs aus dem Plasma beziehungsweise Antiserum der Tiere isolieren und reinigen. Im Vor-Kit-Zeitalter fällten sie hierzu zunächst die Plasma-Proteine mit Ammoniumsulfat, das sie bis zu einer Endkonzentration von 25 Prozent zugaben. Nachdem sie die Proteine zentrifugiert und entfernt hatten, kamen die IgGs an die Reihe, die mit fünfzigprozentigem Ammoniumsulfat präzipitiert wurden.
Die beiden Fällungsschritte sowie die anschließende Dialyse der erhaltenen Antikörperlösung, um das Ammoniumsulfat wieder loszuwerden, erfordern jedoch viel Handarbeit und dauern mehrere Tage. Deutlich schneller und einfacher lassen sich IgGs mit Antikörperreinigungs-Kits isolieren, die fast durch die Bank auf kleinen Affinitätssäulen oder Kügelchen (Beads) basieren, die mit Protein A oder Protein G bestückt sind. Diese ursprünglich von Staphylococcus aureus (Protein A) und Streptococcus sp. (Protein G) stammenden Oberflächenproteine binden mit hoher Spezifität an den Fc-Teil vieler IgGs.
Während Protein G eine hohe Affinität zu den meisten IgGs hat, ist Protein A etwas wählerischer und wird zum Beispiel von IgGs aus Hamstern, Ratten oder Schafen kaum angezogen. Für die Affinitäts-Reinigung werden rekombinant exprimierte Varianten von Protein A und G entweder separat oder manchmal auch in Kombination an Chromatographie-Harze geheftet, oder mit dem Oberflächenmaterial magnetischer Beads verknüpft. Oft genügt mit diesen ein einziger Chromatographie-Schritt, um Reinheiten der isolierten Antikörper von mehr als 98 Prozent zu erzielen.
In Forschungslaboren werden auch die deutlich instabileren und zur Aggregation neigenden IgMs häufig mit Affinitätssäulen geputzt. Als Bindematrix dienen hier aber nicht Protein A oder G, sondern das Mannose-bindende Protein beziehungsweise Mannose-bindende Lektin (MBL), das zumeist auf Agarose immobilisiert ist.
Für die Reinigung im größeren Maßstab sind Protein A und G oder auch andere spezifische Liganden für die Affinitäts-Chromatographie ein ziemlich teurer Spaß. Antikörperproduzenten und Pharmalabore weichen deshalb meist auf die klassische Ionenaustausch-Chromatographie aus und füllen die Säulen zum Beispiel mit weitaus günstigeren Anionentauschern wie Diethylaminoethyl-(DEAE)-Agarose, um saubere IgGs, IgMs und insbesondere auch monoklonale Antikörper (mAb) zu erhalten. Aber auch diese Techniken haben mit den generellen Nachteilen chromatographischer Reinigungsmethoden zu kämpfen – etwa begrenzten Bindungskapazitäten, hohem Zeitaufwand und teurem Unterhalt der Geräte.
Einige Gruppen arbeiten deshalb hartnäckig an Alternativen zu chromatographischen Verfahren und folgen dabei dem immer öfter zu hörenden Slogan: Alles, nur keine Chromatographie (Anything but Chromatography, ABC). Eines dieser chromatographiefreien Reinigungskonzepte für Antikörper präsentierte im letzten Jahr Guy Patchorniks Gruppe von der Ariel University in Israel, zusammen mit Kollegen aus Indien (MABS 11 (3): 583-92). Da sich Antikörper auch mit der Hydrophoben-Interaktions-Chromatographie (HIC) reinigen lassen, ging Patchornik davon aus, dass Antikörper offensichtlich etwas stärker an hydrophobe Harze binden als andere wasserlösliche Proteine. Also müssten sie sich, so seine Idee, auch mit hydrophoben Detergenzien-Aggregaten einfangen lassen.
Die Aggregate generierten Patchorniks Mitarbeiter, indem sie zunächst den hydrophoben Chelator Bathophenantrolin (Batho) zu einer wässrigen Tween-20-Lösung gaben und die Mischung vortexten. Hierdurch erhielten sie Tween-20-Mizellen, deren Oberflächen mit dem hydrophoben Teil der Batho-Moleküle dekoriert waren. Diese sogenannten Engineered Micells mischten sie anschließend mit einer Eisensulfatlösung und vortexten erneut. Die weitere Reaktion lief dann praktisch automatisch ab: Die Fe2+-Ionen bilden mit den an der Phasengrenze zwischen Mizellen und Wasser positionierten Batho-Molekülen hydrophobe (Batho)3:Fe2+-Komplexe, die zu einer Vernetzung der Mizellen zu hydrophoben Tween-20-Aggregaten führen.
Ob die Aggregate für die Reinigung von Antikörpern taugen, testeten die Israelis mit einer Mischung aus polyklonalen humanen IgGs, die als künstliche Kontamination E.-coli-Lysat enthielt. Die Reinigungsprozedur, die sie hierzu verwendeten, ist denkbar einfach: Die Antikörpermischung wird fünf Minuten mit den vorgefertigten Tween-20-Aggregaten inkubiert und danach zwei Minuten zentrifugiert. Mit einer 50-millimolaren Isoleucin-Lösung (pH 3,8) lassen sich die IgGs anschließend in wenigen Minuten aus den Aggregaten isolieren. Das Ganze funktioniert auch in Serum-freiem Hybridoma-Medium, das in der Regel für die Herstellung monoklonaler Antikörper eingesetzt wird – ebenso wie in Gegenwart von Rinderserumalbumin (BSA), das in Zellkulturmedien für die Antikörperproduktion ebenfalls häufig zu finden ist.
Da sowohl die Reinheit der mit den Tween-20-Aggregaten isolierten IgGs als auch die Ausbeute nur unwesentlich schlechter sind als mit der Protein-A-Affinitätschromatographie, ist Patchornik überzeugt, dass seine Methode eine echte Alternative zur klassischen Reinigung darstellt. Er könnte sich sogar vorstellen, dass sie Protein-A-Säulen bei der Reinigung therapeutischer Antikörper ablöst.
Mit einer Kombination aus Affinitäts-Ligand, Präzipitation sowie magnetischen Nanopartikeln umgeht Ana Cecília A. Roques Gruppe an der Universidade Nova in Lissabon die chromatographische Antikörperreinigung (Biotechnol. J. DOI:10.1002/biot.202000151).
Die drei einzelnen Techniken sind natürlich nicht neu. Neu ist aber ihre Verschmelzung zur sogenannten Affinity Magnetic Precipitation. Im Grunde ist diese äußerst simpel – der komplizierteste Schritt ist die Herstellung magnetischer Nanopartikel, die mit einem Triazin-Liganden bestückt sind, der spezifisch an Antikörper bindet.
Die Partikel werden danach mit 20-prozentigem PEG3350 vermischt, das als Fällungsmittel dient. Bei 4°C wird der Rohextrakt eine Stunde mit der Mischung inkubiert und auf einem Orbitalschüttler geschüttelt. Anschließend legt man für fünfzehn Minuten ein magnetisches Feld an, um die gefällten magnetischen Partikel mit den daran haftenden Antikörpern vom Überstand abzutrennen. Mit einer neutralen PBS-Lösung werden die Antikörper schließlich schonend von den Nanopartikeln abgelöst.
Roques Team isolierte mit der Methode polyklonale Antikörper aus humanem Serum mit 50-prozentiger Ausbeute und einer Reinheit von achtzig Prozent. Noch deutlich bessere Werte erzielten die Portugiesen bei der Reinigung monoklonaler Antikörper.
Antikörperreinigungs-Kits im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 9/2020, Stand: August 2020, alle Angaben ohne Gewähr)