Kleine Putzkolonnen
Produktübersicht: Proteinreinigungs Kits

Früher war die Proteinreinigung nur etwas für Frustrations-tolerante. Heute ist sie Dank Kits eine Routinearbeit.

„Der typische deutsche Professor eines naturwissenschaftlichen Faches lebt und stirbt im Laboratorium.“ So heißt es in einem Nachruf aus dem Jahr 1923 auf den deutschen Biochemiker und Pionier der Proteinreinigung Franz Hofmeister, der bereits 1889 Ovalbumin reinigte und kristallisierte. Zu Hofmeisters Zeiten war die Proteinreinigung tatsächlich noch eine Lebensaufgabe und selbst in den achtziger Jahren des 20. Jahrhunderts verbrachten viele Biochemiker ein ganzes Doktorandenleben damit, ein einziges Protein zu isolieren. Daran gestorben ist vermutlich niemand, aber für viele war es eine üble Plackerei und ein ständiger Kampf mit den Tücken chromatographischer Trennverfahren und den unberechenbaren Launen von Proteinen, die sich just im letzten Reinigungsschritt verabschiedeten.

Die Erlösung für die leidgeplagten Proteinputzer brachten Proteinreinigungs Kits die seit etwa 25 Jahren das Leben der Biochemiker erheblich erleichtern und dafür sorgen, dass heute (fast) niemand mehr an der Reinigung eines Proteins verzweifeln muss. Sie enthalten meist kleine Affinitätschromatographie-Säulen, an deren Säulenmaterial Proteine binden, die mit einem kurzen, zur jeweiligen Säulenoberfläche passenden, Peptid-Anhängsel (Tag) versehen sind. Die populärste Affinitätschromatographie-Methode, auf der unzählige Proteinreinigungs Kits aufbauen, ist die Metallchelat-Chromatographie (IMAC) die Jerker Porath und seine Kollegen bereits 1975 entwickelten (Porath et al., Nature 258, 598-9). Im Grunde müsste in jedem Proteinlabor ein kleiner Andachtsschrein stehen, der Porath und seinen Mitstreitern gewidmet ist, denn erst ihre Variante der Affinitätschromatographie machte aus der einst mühevollen Proteinreinigung eine Routineangelegenheit.


Genialer Trick

Die Metallchelat-Chromatographie basiert auf der Wechselwirkung von mehrzähnigen Liganden wie Nitrilotriessigsäure (NTA) mit zweiwertigen Übergangsmetall-Ionen, zum Beispiel Ni2+ oder Co2+, aus denen sehr stabile oktaedrische Chelatkomplexe resultieren. Da NTA ein vierzähniger Ligand ist, können zwei weitere einzähnige Liganden, etwa die Histidin-Reste von Proteinen, die verbliebenen Oktaederplätze besetzen. Schon lange Zeit vor Porath forschten Koordinationschemiker an ähnlichen Chelatkomplexen, aber erst Poraths Team kam auf die Idee diese für die Affinitätschromatographie von Proteinen einzusetzen.

Der entscheidende Trick war NTA mit Agarose zu verknüpfen und die NTA-Agarose als immobilisierten Chelatkomplex-Bildner in eine Chromatographie-Säule zu packen. Gibt man Ni2+-Ionen hinzu bilden sich in der Säulenmatrix Ni-NTA-Komplexe, die begierig darauf warten die Histidin-Reste von Peptiden oder Proteinen in ihren Oktaeder einzubauen. Die Affinität zu Histidin ist bei einigen Metallchelat-Komplexen so stark ausgeprägt, dass bereits ein einziger Histidin-Rest ausreicht, um ein Protein an der Säule festzuhalten. Da Biochemiker und Molekularbiologen die IMAC-Methode in der Regel für die Reinigung rekombinanter Proteine einsetzen, gehen sie jedoch auf Nummer sicher und hängen meist einen Schwanz aus sechs Histidin-Resten an den N- oder C-Terminus des Proteins.

Am Grundprinzip der Metallchelat-Chromatographie hat sich in den mehr als dreißig Jahren seit ihrer Einführung nichts Wesentliches geändert, inzwischen sind aber etliche IMAC-Varianten erhältlich. Statt einfacher Agarose packen die Hersteller quervernetzte Agarose, modifizierte Cellulose, Silica, oder poröse Glasmatrizen in die Minisäulen. Als meistverwendeter Chelatbildner hat sich Iminodiessigsäure etabliert, in einigen Kits finden sich aber auch exotischere Chelatoren wie 8-Hydroxychinolin oder Carboxymethylaspartat. Auch bei den Zentralionen der IMAC-Komlexe hat sich einiges getan. Mittlerweile haben die IMAC-Entwickler nahezu alle in Frage kommenden Metall- und Übergangsmetallionen durchprobiert, die das Periodensystem hergibt, angefangen bei den zweiwertigen Ionen von Kupfer, Nickel, Zink, Kobalt und Kalzium bis hin zu den dreiwertigen Ionen von Aluminium, Eisen oder Chrom. In den allermeisten IMAC-Kits sitzen jedoch noch immer Kobalt- oder Nickel-Ionen im Zentrum der Metallchelatkomplexe.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 01/2011, Stand: Dezember 2010, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 22.02.2011