Im Gespräch: Stefan Knapp, Pharmazeutische Chemie der Universität Frankfurt
Proteine pflegen intensive Beziehungen untereinander. Solche Protein-Protein-Interaktionen, kurz PPIs, sind unter medizinischen Aspekten von großem Interesse, weil sie Krankheiten verursachen oder beeinflussen können. Eine gezielte Steuerung, speziell die Unterbindung von PPIs ist daher auch ein wichtiges Thema in der Pharmakologie. Darüber sprach Karin Hollricher mit dem Chemiker Stefan Knapp von der Goethe-Universität in Frankfurt.
Laborjournal: Sie bezeichnen Protein-Protein-Interaktionen als „intractable targets“, also widerspenstige Angriffsziele. Warum?
Knapp: Die meisten Interaktionen zwischen Proteinen finden zwischen großen Oberflächen der beteiligten Moleküle statt. Aus pharmakologischer Sicht ist es sehr schwierig, Moleküle zu finden, die solche Interaktionen stören können – denn Inhibitoren müssen klein sein, um im Körper wirken zu können.
Von welchen Größenordnungen reden wir hier?
Knapp: Die beteiligten Oberflächen sind 1.000 bis mehr als 3.000 Quadrat-Ångström groß, oft sehr flach und ohne definierte Taschen. Ein pharmakologisch wirksamer Inhibitor sollte weniger als 500 Dalton groß sein. Das bedeutet, dass er nur einen kleinen Bereich einer so großen Oberfläche abdecken würde.
Und das ist zu wenig, um den flächigen Kontakt zwischen zwei Proteinen zu stören?
Knapp: Ja, leider. Beispielsweise hat man noch immer keinen Inhibitor gegen den Transkriptionsfaktor MYC gefunden, der bei vielen Krebserkrankungen eine treibende Rolle spielt.
Solche großflächigen Kontakte kann man nur dann effizient beeinflussen, wenn es Hotspots auf den Oberflächen gibt und man gezielt dafür Inhibitoren entwickelt. Hotspots sind lokal begrenzte Bereiche, die besonders wichtig für die PPI sind.
Und bei MYC ist es auch ein Problem der großen Oberflächen?
Knapp: Genau. Um aktiv werden zu können, bildet das MYC-Molekül ein Heterodimer mit einem MAX-Molekül. Der Kontakt erfolgt entlang einer ziemlich großen helikalen Struktur. Dagegen kann ein kleines Molekül nichts ausrichten.
Doch obwohl sich PPIs so widerspenstig zeigen, haben Sie und Ihre Kollegen sehr wohl neue Inhibitoren identifizieren können. Erzählen Sie doch mal.
Knapp: Wir haben zumindest die Basis für die Entwicklung neuer Inhibitor-Moleküle gelegt. Allerdings waren wir zu Beginn unserer Arbeit gar nicht darauf aus, Interaktionen zwischen Proteinen zu stören. Wir kamen von einer ganz anderen Seite. Seit einiger Zeit weiß man ja, dass Krankheiten nicht nur durch den genetischen Code, sondern auch epigenetisch beeinflusst werden. Wir begannen daher, nach kleinen Molekülen zu suchen, die den epigenetischen Code – also die Modifikationen an Histonen – verändern, indem sie Enzyme hemmen, die diese Modifikationen schreiben, lesen oder löschen. Es gibt etliche Arten von epigenetischen Modifikationen, und wir waren speziell an Acetylierungen interessiert. Die „Leser“ oder Reader von solchen Acetylierungen sind so genannte Bromdomänen. Dies sind Module in Molekülen, die speziell acetylierte Lysine erkennen. 2009 fingen wir an der Oxford University an, uns mit dem Thema zu beschäftigen. Unterstützt aus den Töpfen von Stiftungen und öffentlichen Förderern suchten wir zusammen mit Kollegen aus dem Dana Farber Institute in Boston und einer ganzen Reihe von Pharmafirmen gezielt nach Inhibitoren solcher Bromdomänen.
Wie sind Sie dabei vorgegangen? Haben Sie auf klassische Hochdurchsatz-Screenings gesetzt? Oder auf das so genannte Rational Design, wobei man am Proteinmodell im Computer passende Moleküle entwirft?
Knapp: Wir haben tatsächlich jede Menge Proteine kristallisiert und davon Strukturen gemacht. Die Inhibitoren identifizierten wir aber in einem zellbasierten, phänotypischen Hochdurchsatz-Screening, das konkret GlaxoSmithKline durchführte. Die wussten von massenspektroskopischen Untersuchungen, dass Benzodiazepine an eine Familie der Bromdomänen binden. Andere Inhibitoren haben wir dann durch strukturbasiertes Design optimiert.
Benzodiazepine sind doch Schlafmittel. Schlafmittel gegen Histon-Modifikationen?
Knapp: Ja, sicher. Aber nicht ganz – dazu kommen wir gleich. Jedenfalls haben wir alle bereits zugelassenen Wirkstoffe getestet. Und dabei entpuppte sich Alprazolam, ein zugelassenes Benzodiazepin von Pfizer, als ein Molekül, das an Bromdomänen bindet. Und wir entdeckten, dass auch Thienodiazepin daran bindet. Diese Variante bindet übrigens nicht wie Benzodiazepine an den GABA-A-Rezeptor und wirkt demzufolge auch nicht als Schlafmittel. Unseren ersten Inhibitor dieser Art nannten wir JQ1.
Welche Moleküle hatten Sie denn als Target genommen?
Knapp: Brd4. Dieses Molekül gehört zu den BET-Proteinen. BET steht für Bromo- and Extra-Terminal Domain. Wir Menschen haben vier Brd-Proteine, die jeweils zwei Bromdomänen enthalten. Es sind allesamt Histon-Deacetylasen. Brd4 bindet an acetyliertes Histon 4 und rekrutiert damit eine Kinase. Diese phosphoryliert den C-Terminus der DNA-Polymerase II an zwei Positionen: am Serin 5, was zur Initiation der Transkription führt – und am Serin 2, wodurch die Elongation startet. Somit bewirkt die Deacetylierung eine Transkription.
Ist denn ein Inhibitor, der die Deacetylierung von Histonen unterbindet, nicht toxisch, wenn nicht gar letal? Schließlich kann er doch auf das gesamte Chromatin Einfluss nehmen.
Knapp: Generelle Transkriptions-Inhibitoren wären bestimmt toxisch. Wir haben jedoch festgestellt, dass Brd4 hauptsächlich an sogenannten Enhancern wirkt. Diese Elemente verstärken die Expression von gewebespezifischen Genen. In einigen Krebszellen bedeutet dies, dass gezielt Wachstums-fördernde Gene inhibiert werden, wie zum Beispiel das Oncogen c-Myc.
JQ1 ist also nicht letal?
Knapp: Erste klinische Studien zeigten, dass BET-Inhibitoren kurzfristig gut vertragen werden. Besonders interessant sind solche für die Behandlung einer selten Krebsart, die man NMC nennt. NMC steht für NUT Midline Carcinoma. Dieser Krebs entsteht dadurch, dass das Gen von NUT (von nuclear protein in testis) mit Brd4 oder Brd3 fusioniert. Im Gegensatz zu den meisten soliden Tumoren findet man in NMC keine anderen Mutationen oder genetischen Veränderungen. Der Tumor ist daher stark von dem Fusionsprotein abhängig. Die ersten Experimente mit BET-Inhibitoren wurden am Dana Farber Institute an Krebszellen ausgeführt, die von einem NMC-Patienten isoliert wurden. Die Zellen stammten von einem primären Krebs, sie wuchsen sowohl in Kultur und bildeten Tumore in Mäusen. Dieses bösartige Wachstum konnten wir mit unserem Inhibitor JQ1 stoppen. Nach einer Woche war der Tumor im Prinzip verschwunden, die Mäuse überlebten. Dank dieser Kooperation haben wir das Ergebnis schon kurz nach der Entwicklung des Inhibitors Ende 2010 publizieren können.
Das ist aber sehr schnell, nur ein oder eineinhalb Jahre nach dem Beginn des Projekts.
Knapp: Stimmt. Die erste klinische Studie begann dann auch schon 2012. Das ist für pharmazeutische Forschung wirklich eine Rekordzeit. Zum Vergleich: der erste Kinase-Inhibitor Gleevec wurde 1992 entdeckt und 1998 kam er in die Klinik. Jetzt laufen bereits 18 klinische Studien mit Bromdomänen-Inhibitoren. Wir haben nämlich sämtliche Daten und Reagenzien direkt veröffentlicht und den Inhibitor jedem gegeben, der uns gefragt hat. Unsere Arbeitsgruppe hat nichts patentiert oder kommerzialisiert. Denn unser primäres Ziel war und ist es, schnell neue therapeutische Konzepte zu entwickeln, indem wir unbürokratisch neue Werkzeuge wie zum Beispiel JQ1 finden und zur Verfügung stellen; übrigens nicht nur der Wissenschaft, sondern auch privaten Labors, die dann diese Verbindungen zu klinischen Inhibitoren weiterentwickeln. Die sind dann auch sehr schnell eingestiegen, was die große Anzahl von aktuellen klinischen Studien erklärt. Ich denke, dass diese Beispiel zeigt, dass Open Science den Prozess der Kommerzialisierung nicht verhindert, sondern im Gegenteil beschleunigt.
Sie sagten eingangs, PPIs seien schlechte Kandidaten für die Entwicklung von Inhibitoren. Sind Bromdomänen ein Glückstreffer oder gute Zielmoleküle?
Knapp: Bisher zugelassen sind überhaupt nur solche PPI-Inhibitoren, die in diskrete Bindetaschen passen und dadurch den Kontakt zwischen Proteinen verhindern. Und in diese Klasse gehören die Bromdomänen und ihre Inhibitoren auch – nur sind sie ja noch in der Entwicklung. Wir haben eine Drugability-Analyse gemacht und dabei gefunden, dass Bromdomänen tatsächlich ziemlich gute Targets sind. Sie bilden definierte Taschen, die einerseits groß genug für einen Inhibitor sind, andererseits ausreichend kleine Oberflächen haben. Außerdem sind die Interaktionen von Bromdomänen mit den acetylierten Histonen ziemlich schwach, so dass sie sich eher inhibieren lassen.
Welche anderen PPI-Inhibitoren sind denn noch in der Entwicklung?
Knapp: Gerade interessant sind Moleküle, die E3-Ligasen bei ihrer Arbeit behindern. E3-Ligasen ubiquitinieren Proteine und markieren sie damit zur Zerstörung im Proteasom. Diese Enzyme spielen anscheinend bei einigen Erkrankungen eine wichtige Rolle. Übrigens ist die Cereblon-E3-Ligase das Ziel von Thalidomid, dem Wirkstoff des Medikaments Contergan. Thalidomid inhibiert Cereblon und verhindert so den Abbau von Proteinen. Das ist die Basis für den teratogenen Effekt des Wirkstoffes. Der ist derzeit als Medikament zur Behandlung von Lepra und verschiedenen Lymphomen und Leukämien zugelassen. Vielleicht kann man E3-Ligasen aber nicht nur stoppen, sondern ihre Aktivität steigern – und damit gezielt den Abbau solcher Proteine ankurbeln, die man pharmakologisch nicht direkt inhibieren kann. Letzten Endes ist ja die vorhin beschriebene Hemmung von MYC durch JQ1 auch eine indirekte Hemmung, denn der Inhibitor bindet ja nicht an das MYC- oder an das MAX-Protein, sondern an eine Histon-Deacetylase.
Zum Schluss: Wo steht Ihrer Meinung nach die Forschung in diesem Feld?
Knapp: Ganz klar am Anfang. Kinase-Inhibitoren haben schon vierzig Jahre Geschichte, PPI-Inhibitoren dagegen erst etwa zehn.