(11.11.2019) Kleine nicht-codierende RNAs regulieren die Proteinsynthese oder wehren Parasiten ab – RNA-Interferenz ist mehr als nur eine Labormethode. Und dann gibt es auch noch längere RNAs, die sogar Chromosomen stilllegen können.
Bis in die 1990er-Jahre hinein war die Genetik im Bio-Lehrbuch schön übersichtlich: Die DNA codiert für Proteine. Handliche Kopien dieser Protein-Baupläne gelangen als mRNA vom Zellkern zu den Ribosomen. Wann und wie die Gene abgelesen werden, entscheiden wiederum Proteine, die als Transkriptionsfaktoren in den Zellkern gelangen. Wäre damit das Modell der Genetik und Genregulation bereits vollständig, wären mehr als neunzig Prozent des menschlichen Genoms Schrott. Warum aber investiert die Zelle Energie, um den größten Teil dieses vermeintlichen DNA-Mülls auch in RNA zu transkribieren?
Dass es auch RNA gibt, die nicht für Proteine codiert und trotzdem wichtig ist, war eigentlich schon damals bekannt: Schließlich bestehen auch Ribosomen zum Großteil aus RNA, die ja auch keine Baupläne für einzelne Proteine enthält – und doch für die Proteinsynthese unerlässlich ist. Ebenso die transfer RNA (tRNA), die den Basencode in Aminosäuren übersetzt. Heute kennen wir aber noch jede Menge weiterer „nicht-codierender RNAs“, kurz: ncRNAs. Und viele davon sind mehr als bloß Junk.
Klammern wir die rRNAs und tRNAs aus, dann sind die populärsten Vertreter unter den ncRNAs wohl die microRNAs (miRNAs). „Die kennen wir am längsten, und sie sind inzwischen intensiv beforscht“, weiß der Biochemiker Gunter Meister, der an der Uni Regensburg eine Arbeitsgruppe zur RNA-Biologie leitet. „Ich habe auch schon die Early Days mitbekommen“, erinnert er sich an die Zeit nach der Jahrtausendwende – miRNAs begleiten ihn bereits seit seiner Doktorarbeit. So war er Postdoc im Labor von Thomas Tuschl an der Rockefeller University in New York; und Tuschl wiederum gehörte zu den ncRNA-Pionieren. Sein Team hatte 2001 die RNA-Interferenz (RNAi) als molekularbiologische Methode auf Säugerzellen übertragen (Nature 411(6836): 494-8).
Bei der RNAi reagiert die Zelle auf doppelsträngige RNA und baut RNA mit komplementären Basen ab. Forscher nutzen das Prinzip, um gezielt Gene durch ein Knock-down ihrer mRNA herunterzuregulieren. Doch die Natur hat dieses Prinzip wohl nicht als Labormethode für experimentierfreudige Wissenschaftler erfunden. Es gibt nämlich viele natürliche kleine RNAs, die über diesen Mechanismus wirken. So auch die miRNAs.
miRNAs sind zwanzig bis fünfundzwanzig Nukleotide lang und kommen in so gut wie allen Eukaryoten vor. „In der Bäckerhefe scheinen die miRNAs verlorengegangen zu sein“, schränkt Meister ein, „doch in verwandten Hefe-Spezies findet man sie wieder.“ Ob Arabidopsis, C. elegans, Fliege oder Mensch: Überall gibt es miRNAs, und sie sind stark konserviert. Daher können Bioinformatiker sie auch leicht in Sequenzdatensätzen entdecken.
Codiert sind miRNAs im Genom und werden zunächst zu einem Vorläufer transkribiert, der primary (pri-)miRNA. Die faltet sich zu einer Hairpin-Struktur mit einem „Stamm“, der durch Paarungen komplementärer Basen entsteht und auf der einen Seite eine einsträngige Schleife wirft. Auf der anderen Seite, sozusagen „unterhalb“ des Stamms, schauen bei dieser Vorläufer-Variante der miRNA beiderseits noch längere einsträngige Enden lose heraus – einmal in Richtung 3’ und einmal in Richtung 5’. Doch schon im Zellkern schneidet ein Proteinkomplex, der Microprocessor, diese Enden ab und verarbeitet die pri-miRNA so zur prä-miRNA. Ein Protein namens Exportin-5 transportiert die prä-miRNA aus dem Kern heraus, wo die RNAse Dicer auf ihren Einsatz wartet: Dicer schneidet die Schleife der Hairpin ab, so dass ein kurzes doppelsträngiges RNA-Molekül übrigbleibt.
Im nächsten Schritt nimmt ein Argonautenprotein die RNA auf, behält anschließend aber nur einen der beiden Stränge als Leitstrang der miRNA. Argonautenprotein und miRNA bilden gemeinsam einen RNA-induced Silencing Complex (RISC). Wie der Name schon erahnen lässt, kann RISC die Translation einer mRNA zu einem Protein „stilllegen“. Seine Ziel-mRNA findet er durch Basenpaarungen zwischen miRNA und mRNA. Relevant für die Basenpaarung ist ein kleiner Abschnitt von nur sechs bis acht Basen auf der miRNA. „Dieser Seed beginnt mit der zweiten Base und endet etwa bei Nukleotid Nummer acht“, erklärt Meister und ergänzt: „Der Seed-Match ist wichtig für die Funktion des RISC.“ Binden RISC und mRNA aneinander, wird der Abbau der mRNA eingeleitet.
Bestimmte miRNAs reifen auch über andere Wege heran. Zum Beispiel enthalten einige Introns miRNA-Sequenzen, die aus einem Transkript herausgespleißt werden und dann nicht mehr vom Microprocessor bearbeitet werden müssen. Diese sogenannten „Mirtrons“ können sofort als prä-miRNA ins Cytoplasma exportiert und auf einen Dicer geladen werden. Mehr zur miRNA-Synthese und auch zu solchen „nicht-kanonischen“ Spezialfällen der Reifung hat Meister zusammen mit zwei Kollegen seiner Arbeitsgruppe vergangenes Jahr in einem Review zusammengefasst (Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 20(1): 5-20).
Doch wie zuverlässig findet die einzelne miRNA ihr Ziel, wenn für das Matching eine Sequenz von manchmal nur sechs Basen ausreichen muss? Tatsächlich kann eine miRNA viele unterschiedliche mRNAs erkennen und somit deren Abbau initiieren. „Deshalb stößt man in der Bioinformatik auch an Grenzen“, verweist Meister auf Algorithmen, die regulatorische Effekte von miRNAs voraussagen sollen.
Auch experimentelle Daten seien nicht leicht zu interpretieren: „Wenn eine microRNA hunderte von Genen reguliert, dann messen wir vielleicht unterschiedliche mRNA-Mengen, wenn wir diese microRNA überexprimieren oder inhibieren. Aber die Frage ist immer, wann ein Unterschied wirklich biologisch relevant ist.“ Dass nur wenige Nukleotide für das Matching dienen, überrascht Meister allerdings nicht. „Wir kennen auch etliche RNA-Bindeproteine, die ohne miRNA direkt eine mRNA binden und auf ähnliche Weise die Translation regulieren“, verweist er auf andere Prozesse posttranskriptionaler Modifikationen. „Und auch diese RNA-Bindeproteine benutzen oft sechs bis sieben Nukleotide als Bindeplattform.“ Es sei also nichts Außergewöhnliches, dass solch kurze Nukleotidfolgen als Erkennungssequenzen genutzt werden.
Dennoch können miRNAs im gemeinsamen Zusammenspiel doch wieder sehr spezifisch wirken. „Stellen Sie sich eine lange 3’-UTR einer mRNA vor, die vielleicht zehn unterschiedliche Target Sites für verschiedene miRNAs trägt“, nennt Meister ein Beispiel. Für jede einzelne miRNA mag die Wahrscheinlichkeit vergleichsweise gering sein, dass sie auf diese mRNA trifft. „Sind in einer Zelle aber alle zehn passenden miRNAs gleichstark aktiv, dann ist auch die Wahrscheinlichkeit um das Zehnfache erhöht, dass mindestens eine davon bindet“, schildert Meister eine Möglichkeit zur Regulation.
Wie viele miRNAs es in einem Organismus wie dem Menschen gibt, ist noch nicht abschließend geklärt. „In den Datenbanken sind zwar sechs- bis siebentausend annotiert, doch viele Experten sind sich sicher, dass es maximal achthundert miRNAs gibt, die wirklich relevant sind“, fasst Meister den aktuellen Stand der Forschung zusammen.
miRNAs sind aber nur einer von vielen Wegen, mRNA mithilfe kurzer RNA-Stränge „zum Schweigen zu bringen“. „Gerade in Pflanzen hat man solche Effekte schon in den 1990er Jahren gesehen“, blickt Meister zurück. Als erster Hinweis auf die RNA-Interferenz wird gern eine Publikation aus dem Jahre 1990 genannt: Carolyn Napoli et al. wollten die Blütenfärbung von Petunien verstärken und schleusten zusätzliche Kopien des Gens in die Pflanzen. Doch die Färbung wurde schwächer oder ging ganz verloren (Plant Cell 2(4): 279-89). Ähnliche Beobachtungen wurden später auch von anderen Forschergruppen aus ganz anderen Organismen wie etwa C. elegans berichtet. Man erkannte, dass die Dämpfung der Proteinsynthese vor allem dann auftritt, wenn doppelsträngige RNA in die Zelle gelangt oder in der Zelle entsteht, und wenn deren Basenfolge auf die proteincodierende mRNA passt.
Gibt man doppelsträngige RNA von außen in eine eukaryotische Zelle hinein, so wird diese zunächst in kleinere Fragmente zerschnitten. Zumindest bei Pflanzen, Würmern und Fliegen. Hieran sind Proteine wie der oben bereits erwähnte Dicer beteiligt. Die so entstandene small interfering RNA (siRNA) findet dann ebenfalls mithilfe eines Argonautenproteins ein komplementäres Ziel auf der mRNA und markiert diese für den Abbau. In den neunziger Jahren war diese Erkenntnis revolutionär, denn auf einmal konnten Forscher die Translation von Genen in einem bestimmten Entwicklungsstadium gezielt herunterregulieren, ohne das Genom selbst verändern zu müssen. Sogar ein Nobelpreis sprang dabei heraus (2006 für Andrew Fire und Craig Mello).
Ausgerechnet in Säugerzellen klappte die Sache mit der experimentellen RNAi aber nicht. „Lange doppelsträngige RNA wird dort nicht toleriert, sondern sofort als fremd erkannt“, so Meister, „und dann wird die Zelle abgetötet“. Meisters früherer Chef, Thomas Tuschl, hatte dann die Lösung für das Problem: Die doppelsträngige RNA muss einfach kurz genug sein. „Dann können wir das System austricksen“, resümiert Meister.
Vermutlich geht die RNAi auf einen evolutionär alten Mechanismus zur Virenabwehr zurück – lange vor dem adaptiven Immunsystem. Indem eine einzelne virale RNA nicht bloß abgebaut, sondern in kleine Stücke zerteilt auf verschiedene Argonauten geladen wird, können viele weitere virale Sequenzen gefunden und unschädlich gemacht werden. Mithilfe der RNAi erweisen sich sogar Pflanzen als äußerst wehrhaft, und das nicht nur gegen Viren.
So verteidigt sich Arabidopsis gegen den Pilz Botrytis cinerea, indem sie Vesikel mit siRNA belädt und ausscheidet. Die Vesikel „infizieren“ dann gewissermaßen den Pilz mit der pflanzlichen siRNA, die gezielt mRNA des Parasiten herunterreguliert (Science 360 (6393): 1126-9). Natürlich funktioniert solch eine Interferenz über die Artgrenzen hinweg auch in umgekehrter Richtung, zum Beispiel bei Seidenpflanzen (Custcuta). Diese geben miRNAs an ihre Wirtspflanzen weiter, auf denen sie wachsen. Offenbar manipuliert die Seide so die Translation im Wirt zu ihren eigenen Gunsten (Nature 553(7686): 82-5). Auf RNA-Ebene sorgt die Evolution also für ein ständiges Wettrüsten zwischen den Arten.
Auch David Rosenkranz war viele Jahre lang kleinen nicht-codierenden RNAs auf der Spur. Der Molekularbiologe und Bioinformatiker arbeitet inzwischen beim Senckenberg-Zentrum für Humangenetik in Frankfurt am Main. Doch bis August 2019 leitete er die Small RNA Group am Institut für Organismische und Molekulare Evolutionsbiologie der Uni Mainz. Insbesondere die piRNAs haben es ihm angetan. Die Abkürzung steht für PIWI-interacting RNAs. piRNAs sind mit bis zu 35 Basenpaaren meistens länger als miRNAs. Sie binden an PIWI-Proteine und leiten diese zu einer Ziel-RNA. Auch hier erfolgt die Erkennung des Ziels wieder über Paarungen zwischen komplementären Basen. Anschließend zerschneidet PIWI die über die piRNA gefundenen RNA-Stränge. Im Gegensatz zu miRNAs bringen piRNAs keine mRNAs zum Verstummen, sondern gehen auf die Jagd nach Transposon-Transkripten.
Nun besteht das menschliche Genom zu rund fünfzig Prozent aus Transposon-Sequenzen. „Einige Publikationen gehen sogar von einem noch höheren Anteil aus“, erklärt Rosenkranz, betont aber auch, dass der größte Teil dieser springenden Gene inaktiv ist. „Doch der kleine Anteil, der noch aktiv ist, ist gefährlich und muss stillgelegt werden“, fährt er fort. In somatischen Zellen sorgen Methylgruppen dafür, dass gefährliche Transposons gar nicht erst von der DNA abgelesen werden können. „Für die Keimzellentwicklung werden epigenetische Markierungen zwischenzeitlich aber fast vollständig entfernt, und das ist das Zeitfenster, in dem Transposons wieder aktiv werden.“ Genau in dieser Phase stellt die Zelle auch piRNAs und PIWI-Proteine her.
Bei einigen Tieren kommen piRNAs auch in somatischen Stammzellen vor. „In Säugetieren kannte man piRNAs bislang aber nur aus der Keimbahn, deshalb wollten wir noch mal genauer hinschauen“, so Rosenkranz. Sein Team hatte insbesondere den Hippocampus im Auge. Denn dort sollen sich auch im erwachsenen Säuger noch neue Neuronen aus Stammzellen bilden. Rosenkranz räumt ein, dass diese Neuroneogenese beim Menschen umstritten ist. „Für Nagetiere ist aber nachgewiesen, dass sich neue Neurone bilden.“
Was die Forscher in ihren Experimenten sahen, war zunächst ernüchternd. „Der Hippocampus ist leergefegt von piRNAs“, stellt Rosenkranz fest. Stattdessen fanden sich in den Proben aber unerwartet viele tRNA-Fragmente. Das brandneue Paper hierzu ist bereits vorab als Manuskript auf bioRxiv veröffentlicht (doi: 10.1101/774380).
Nun kommt tRNA in jeder Zelle vor, die Proteine synthetisiert. Dass man auch kürzere Stücke dieser Moleküle in Proben findet, hatte noch vor einem Jahrzehnt kaum jemanden vom Hocker gehauen. Schließlich war es naheliegend, dass es sich einfach um Abbauprodukte oder unfertige Varianten von tRNA handelt. „Wenn man irgendwas in der Zelle sieht und nicht weiß, wofür es gut ist, und das nur ein kleineres Stück von etwas Größerem ist, dann sieht man das erst einmal als Schrott an“, bringt es Rosenkranz auf den Punkt. „Allerdings weiß man von den tRNAs ja sehr genau, dass sie eine extrem konservierte und ganz basale Rolle spielen, und da ist es dann schon überraschend, dass deren Fragmente auch genregulatorische Wirkungen haben“, gibt Rosenkranz zu.
Denn ähnlich wie für miRNAs und siRNAs ist inzwischen auch für tRNA-Fragmente (tRFs) nachgewiesen, dass sie vielfältige Funktionen ausüben. Schon 2009 hatten Forscher der Uni Virginia berichtet, dass tRFs definierte Längen und spezifische Expressionsmuster aufweisen. Für tRF-1001 konnten sie zeigen, dass es in Krebszelllinien stärker exprimiert ist als in normalem Gewebe, und dass die Menge der RNA mit der Zellproliferation korreliert (Genes Dev. 23(22): 2639-49). Krebs, Translation oder Pathogenabwehr – verschiedene Autoren berichten über alle möglichen Aufgaben der tRFs. „Das ist jetzt wie so ein Goldrausch“, meint Rosenkranz, „da entstehen gerade ganz viele neue Paper, die erstmal deskriptiv zusammentragen, was Arbeitsgruppen in Tieren oder Zellkulturen und speziellen Kontexten so an tRNA-Fragmenten gefunden haben.“
Doch was genau hat es nun mit der tRF im Hippocampus auf sich? Schaut man sich deren Anteil an der Gesamtmenge kleiner nicht-codierender RNA-Moleküle an, so liegt der bei den Primaten am höchsten. Im Menschen macht die tRNA dreißig Prozent aller kleinen RNAs aus, im Schimpansen vierzig Prozent und im Makaken sogar die Hälfte. Beim Schwein hingegen lag der Anteil im Hippocampus nur bei zehn Prozent, in Ratte und Maus bei drei.
Die großen Mengen an tRF waren dabei auf den Hippocampus beschränkt. In anderen Hirnarealen und Organen lagen die nachgewiesenen Mengen auch in absoluten Zahlen sehr viel niedriger. Insbesondere eine bestimmte tRF stach im Hippocampus der Primaten heraus: Die 5’-Hälfte der tRNA, die als vollständige Variante das CTC-Codon mit Glutaminsäure verknüpfen würde.
„Wir haben dann Experimente durchgeführt, in denen wir tRNA-Hälften künstlich hergestellt haben“, schildert Rosenkranz die weitere Arbeit an Zellkulturen. Zusätzlich machte das Team Versuche mit Antisense-RNA, um die Funktion der tRNA-Hälften zu dämpfen. Überexpression oder Inhibition können jedoch auch zu unspezifischen Off-Target-Effekten führen. „Nimmt man aber die Schnittmengen aus beiden Versuchen zusammen, dann bleiben weniger Gene übrig, die als Targets in Frage kommen“, so Rosenkranz.
Zur Überraschung der Forscher brauchen die untersuchten tRNA-Hälften keinen Seed Match – also die Paarung beginnend ab der zweiten Base, die über Argonautenproteine vermittelt wird. Stattdessen erkennen diese tRFs ihre Ziel-mRNA über fünf bis zehn Nukleotide, die weiter zur Mitte hin liegen. Darüber hinaus sind sie in der Lage, die Translation einzelner Zielgene auch heraufzuregulieren. „Vielleicht wird durch die Bindung das Transkript vor einem Abbau geschützt“, mutmaßt Rosenkranz. Das alles passt jedoch nicht zur gängigen Vermutung, dass tRFs ebenso wie miRNAs und siRNAs an Argonautenproteine binden. Wäre das der Fall, müsste es ja zunächst einen Seed Match geben und darauf das Silencen der Zielgene folgen.
„Unsere nächste Arbeitshypothese wäre nun, dass diese tRNA-Hälften im Hippocampus von Primaten dafür zuständig sind, nicht benötigte Gene herunter- und benötigte Gene heraufzuregulieren.“ Dabei kann sich Rosenkranz gut vorstellen, dass hierdurch speziell die Neuroneogenese gesteuert wird.
Neben den vielen kleinen nicht-codierenden RNAs gibt es auch die long non-coding RNAs oder lncRNAs. Auf DNA-Ebene überschneiden sie sich manchmal auch mit proteincodierenden Abschnitten und werden in Sense- oder Antisense-Richtung transkribiert. Liegen sie außerhalb proteincodierender Gene, spricht man auch von lincRNA – für long intergenic non-coding RNA. Ganz offensichtlich handelt es sich bei der lncRNA also um eine ziemlich heterogene Gruppe von Nukleinsäuren. Oder, wie es Rosenkranz formuliert: „Alles, was man an nicht-codierender RNA findet und was länger ist als zweihundert Nukleotide, das nennt man halt lncRNA.“ Nicht immer bleibt eine lncRNA an einem Stück. „Viele dieser langen RNAs sind auch Vorläufer-Transkripte für viel kleinere piRNAs“, so Rosenkranz.
Andere lange RNAs modifizieren das Chromatin. So ist Xist daran beteiligt, in weiblichen Säugerzellen jeweils ein X-Chromosom zu inaktivieren. Andere lncRNAs regulieren miRNAs, indem sie diese in sich aufnehmen und festhalten. Man spricht von Sponges, oder dem Sponge Effect, weil der Mechanismus an einen Schwamm erinnert, der etwas in sich aufsaugt. miRNAs können so entweder aus dem Weg geräumt und von mRNAs ferngehalten werden; oder der „Schwamm“ speichert miRNAs so lange, bis sie auf ein anderes Signal hin alle auf einmal freigesetzt werden. Wer hier tiefer einsteigen möchte: Ein aktuelles Review zu regulatorischen Netzwerken nicht-codierender RNAs haben Simona Panni von der Universität in Kalabrien (Italien) und Kollegen diesen Sommer veröffentlicht (Biochim. Biophys. Acta Gene Regul. Mech.: 194417).
Zu guter Letzt: Ein Forscherteam um Carolyn Bertozzi von Stanford berichtet aktuell, womöglich eine glycosylierte nicht-codierende RNA entdeckt zu haben. Wie plausibel die Ergebnisse und die Existenz solcher glycoRNAs sind, diskutiert die Community derzeit. Noch steht dem Paper ein Review-Verfahren bevor, denn bislang sind die Ergebnisse lediglich über bioRxiv veröffentlicht (doi: 10.1101/787614). Andererseits gab es im Zusammenhang mit RNA schon viele Überraschungen – bis hin zu „Ribozymen“, die katalytisch aktiv sind und sich selber zerschneiden können.
Gut möglich also, dass im Reich der Ribonukleinsäuren noch viele Überraschungen auf die Biochemiker und Molekularbiologen warten. Aber auch neue Herausforderungen für die Bioinformatiker. Dabei sollte man die Frage nach der biologischen Relevanz nicht aus den Augen verlieren. Nicht jede miRNA, welche die Proliferationsrate von HeLa-Zellen verändert, muss im vielzelligen Organismus ein wichtiger Weichensteller sein. Und erst recht sollten Wissenschaftler vorsichtig sein, bevor sie vorschnell den nächsten potenziellen Angriffspunkt für die ultimative Krebstherapie verkünden. Dass man in den letzten zwanzig Jahren aber viele Erkenntnisse auch jenseits der Schulbuch-Genetik der Neunziger gewonnen hat, das ist eine gute Nachricht.