Knock out-Bibliothek

von Kirstin Meier (Laborjournal-Ausgabe 10, 2002)

Dem großen Erbgut-Showdown des Menschen reservierten die Zeitungen im Frühjahr 2000 wochenlang einige Seiten. Doch das Medieninteresse erlosch schnell wieder. Und so schrieb auch kürzlich kaum ein Blatt über die erste Funktionsanalyse sämtlicher Gene eines Eukaryoten, der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Über zwanzig Arbeitsgruppen aus Europa, Kanada und den Vereinigten Staaten hatten sich an diesem Großprojekt beteiligt.

Johannes Hegemann vom Institut für Mikrobiologie der Universität Düsseldorf, der dieses Vorhaben mit ins Leben gerufen hat, kennt solch mangelndes öffentliches Interesse bereits: "In Sachen Genetik waren die Hefeforscher immer Vorreiter, doch das wird oft nicht realisiert. Beispielsweise war das Hefegenom 1996 das erste eukaryotische Genom, das vollständig sequenziert wurde."


Barcode für jedes Gen

Während die Öffentlichkeit der Entschlüsselung des Humangenoms entgegenfieberte, waren die Hefeforscher daher längst einen Schritt weiter. Der Sequenzanalyse sollte die systematische Analyse der Funktionen jedes einzelnen Gens der Hefe folgen. Um diese Idee zu realisieren, wollten die Wissenschaftler das Prinzip des Umkehrschlusses nutzen. Systematisch wurde jedes einzelne der rund 6000 Hefegene durch ein Markergen (KanMX) ersetzt, welches mit einer für jedes einzelne Gen spezifischen Sequenz versehen ist, einem molekularen Erkennungscode also. Nun fand das Mammutprojekt im Juli seinen Abschluss. In Nature (Bd. 418, S. 387) präsentierten die Wissenschaftler die erste vollständige Knock out-Bibliothek.

Die Namensgebung lädt zum Vergleich ein: Angenommen, eine Bibliothek ist mit 6000 Büchern ausgestattet. Alle Bücher stammen von einem Autor, haben identische Titel und einen identischen Inhalt, der sich in 6000 Kapitel gliedert. Völlig identisch also, bis auf den einen Unterschied, dass aus jedem Buch je ein Kapitel entfernt wurde; und dass jedes eine spezifische Signatur enthält, mit der ein ordnungsliebender Bibliothekar die jeweilige Eigenart des beschädigten Buches auf den ersten Blick erkenntlich machen könnte.

Das ist das Prinzip der Knock out-Bibliothek. Die Realisierung war natürlich komplizierter. Um den Austausch des jeweiligen KanMX-Konstrukts gegen das richtige Hefegen durch homologe Rekombination zu garantieren, wurde das Markergen durch zwei Nukleotidketten flankiert, die einem kleinen Stück des Promotor- bzw. Endbereichs des jeweils angepeilten Gens entsprachen. Lineare DNAMoleküle schleusten das so präparierte KanMX-Gen in die Hefezelle. Und dann blieb nur die Hoffnung auf positive Kontrollen, dass das Markergen tatsächlich an der richtigen Stelle integriert wurde.

Gen für Gen wurde dieser Austausch wiederholt, bis jedes Gen deletiert und rund 6000 neue Stämme entstanden waren und man jede einzelnen Mutante an ihrer spezifischen Identifizierungssequenz erkennen konnte. "In Anlehnung an den Strichcode im Supermarkt haben wir diese jeweils einzigartige DNA-Sequenz Barcode genannt", erklärt Hegemann. Diese Hefestämme können in Zukunft also nicht mehr ver-wechselt werden.

Vor allem aber ermöglicht der Code zeitsparende parallele Untersuchungen zur Funktion eines Gens. Um beispielsweise zu prüfen, welche Gene für das Wachstum verantwortlich sind, werden alle Deletionstämme gemischt und in einem Nährmedium aufgezogen, das etwa Glukose als Kohlenstoffquelle enthält . Nach etwa 30 Generationen wird das Genom der 6000 Kulturen extrahiert, der Barcode amplifiziert und auf einen GenChip gebracht, der sämtliche Gegenstücke zu allen Barcodes der 6000 Gendeletionen enthält. Die Position A1 des Chips entspricht dann Gen X, usw.

Dennoch erst der Anfang

Ist die entsprechende Nukleotidsequenz also in der Mischung vorhanden, ist sie durch einen Spot auf dem Chip erkennbar. Wenn umgekehrt ein Stamm Y, dessen Gen Y durch das KanMX zerstört wurde, auf Glucose nicht wachsen kann, dann ist er in der Kulturmischung nicht mehr vorhanden und bildet keinen Spot auf dem Chip. Das Gen Y, so ließe sich daraus folgern, ist für die Verwertung von Glukose essentiell.

Mit solchen und vielen anderen Versuchsansätzen nähern sich die Hefeforscher der Funktionsanalyse aller Gene des Genoms. Genaue Aussagen, welche Rolle in diesem Beispiel das Gen Y bei der Glukoseverwertung einnimmt, lassen sich mit diesem Versuch allerdings nicht machen. "Eine detaillierte Funktionsbeschreibung eines Gens dauert auch heute noch viele Jahre", so Hegemann. "Was wir machen, ist eine Funktionsbeschreibung auf einem ersten Niveau." Bis die Genfunktionen der Hefe dagegen wirklich im Detail verstanden sind, dürften noch mindestens zehn Jahre ins Land ziehen, schätzt Hegemann.

Letzte Änderungen: 20.10.2004