Tipp 106:
Eigenes Protokoll statt DNA-Kit
Protokoll für die Extraktion von DNA aus Blättern
Es muss nicht immer der neuste DNA-Kit sein. Eduardo Daniel Souza-Canada verrät, wie einfach Sie mit seiner Methode genomische DNA aus Blättern isolieren können.
"Sehr geehrtes Laborjournal-Team,
nachdem ich viele Methoden ausprobiert und verglichen habe mit denen man genomische DNA aus Blättern gewinnen kann, habe ich eine gefunden, die in unserem Labor gute Ergebnisse liefert. Die Methode ist zuverlässig und schnell und funktioniert bei Weizen, Tabak und Arabidopsis. Sie kommt ohne Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und Polyvinylpyrrolidon (PVP) aus und hat den Vorteil, dass man dazu weder ß-Mercaptoethanol und Phenol noch Proteinkinase A benötigt. Die nach dieser Methode isolierte genomische DNA ist sowohl für die PCR als auch für den Restriktionsverdau geeignet.
Als DNA-Extraktionspuffer verwende ich folgende Lösung:
Puffer für die Extraktion genomischer DNA aus Blättern (Endkonzentrationen):
100 mM Tris-HCl
700 mM NaC
l
50 mM EDTA pH 8,0
pH des Extraktionspuffer: 8,0
RNase 10 µg/µl
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Die einzelnen Extraktionsschritte können Sie in 2 ml Eppendorf-Gefäßen durchführen:
- Zerkleinern Sie 60 bis100 mg Blattmaterial in flüssigem Stickstoff. (Wir verwenden eine Kugelmühle, um die Blätter zu zerkleinern. Das hat den Vorteil, dass diese keinen direkten Kontakt mit dem Stickstoff haben und man viele Proben gleichzeitig behandeln kann.)
- Mit 1330 µl vorgewärmtem (65 °C) Extraktionspuffer gut mischen und 15 Minuten bei 65 °C inkubieren, von Zeit zu Zeit invertieren.
- 1 Minute bei RT abkühlen lassen und 650 µl Chloroform/ Isoamylalkohol zugeben und 5 Minuten leicht schütteln.
- 2 Minuten bei 14000 rpm bei RT abzentrifugieren und Oberphase in neues Reaktionsgefäß überführen. Optional: 10 µl RNase 10 Minuten bei 37 °C zugeben.
- Mit 700 µl Isopropanol gut mischen, 2 Minuten bei RT fällen und anschließend 5-10 Minuten bei 14000 rpm und RT abzentrifugieren.
- Das Pellet mit 1 ml 70 % Ethanol 5 Minuten waschen.
- Schließlich das Pellet trocknen lassen und bei RT in 100 µl bd H2O lösen, optional bei 65 °C, 10 Minuten."
(Eduardo Daniel Souza-Canada, Lehrstuhl Pflanzenphysiologie, Universität Bayreuth)
Letzte Änderungen: 16.08.2006
