Tipp 138:
Mit FRET und FACS auf Partnersuche

Sowohl der Förster-Resonanz­energietransfer als auch die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung basieren auf der Anregung fluoreszenzmarkierter Proteine. Was liegt näher als die beiden zu kombinieren und für die Analyse von Protein-Interaktionen einzusetzen?


Tipp: FRET-FACS

Wenn Proteomiker herausfinden wollen, welche Proteine miteinander wechselwirken, verlassen sie sich meist auf die zwei Klassiker der Proteininteraktions-Analyse, die Ko-Immunopräzipitation (Pull-Down-Assays) und den Yeast-Two-Hybrid-Screen. Beide Methoden haben aber Schwächen. Eine sauber kontrollierte Ko-Immunopräzipitation durchzuführen ist alles andere als trivial, ganz zu schweigen davon, dass man bei der Lyse der Zellen eine ganze Menge „Interaktion“ zerstört. Was nach der Zell-Lyse übrig bleibt, ist eine Detergenzien-Brühe aus Zellmatsch, in der alles Mögliche aneinander hängt oder eben auch nicht. Yeast-Two-Hybrid-Screens, mit denen man native Proteinwechselwirkungen in lebenden Zellen untersucht, funktionieren nur in Hefen, und auch beim aufwändigeren Mammalian-Two-Hybrid Screen muss die Interaktion der Proteine im Zellkern stattfinden damit die Selektionsmarker exprimiert werden.

Eine Alternative zu Ko-Immunopräzipitation und Two-Hybrid-Screen hat kürzlich die Gruppe um Michael Schindler vom Heinrich-Pette-Institut für experimentelle Virologie und Immunologie in Hamburg vorgestellt (Banning et al., PLoS One. 5(2): p. e9344).

Die Gruppe kombiniert für die Proteininteraktions-Analyse die zwei Verfahren, Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) und Durchflusszytometrie (FACS).

Die FRET-Analyse benutzen Forscher schon seit geraumer Zeit, um Protein-Interaktionen in lebenden Säugerzellen in ihrem natürlichen Kompartiment zu studieren. Hierzu müssen die zu untersuchenden Proteine an ein Fluoreszenz-Molekül gekoppelt sein. Interagieren die beiden Proteine, wird Energie von einem angeregten Donor-Molekül (Fluoreszenz-Farbstoff CFP) auf ein Akzeptor-Molekül (Fluoreszenz-Farbstoff YFP) übertragen. Voraussetzung für den Energietransfer ist die direkte räumliche Nähe (weniger als zehn Nanometer) der verwendeten Fluorophore und die spektrale Überlagerung von Donor-Emission und Akzeptor-Anregung. Da die Größe von Proteinen meist auch im Zehn-Nanometer-Bereich liegt, kann man bei einem positiven FRET-Signal davon ausgehen, dass die zwei Proteine nicht zufällig so nah beisammen sind.

In der Theorie ist die Protein-Interaktionsanalyse mittels FRET einfach und einleuchtend, die experimentelle Umsetzung ist aber, wie so oft in den Biowissenschaften, voller Fallstricke. Das fängt damit an, dass man FRET-Experimente bisher mit dem Fluoreszenzmikroskop analysierte, statistische Aussagen daher nur bedingt möglich waren. Hinzu kommt, dass die schwachen FRET-Signale in der starken Hintergrundfluoreszenz fast untergehen. Will der Forscher korrekt arbeiten, muss er etliche Referenzbilder aufnehmen und deren Werte in eine komplexe Berechnung integrieren. Die dazu nötigen Software-Programme und Plug-Ins kosten zum einen Geld, zum anderen ist die Auswertung sehr zeitaufwändig.

Einfacher, schneller und transparenter lassen sich FRET-Signale mit Hilfe eines Durchflusszytometers messen. Mit der von uns entwickelten FRET-FACS-Methode können Biowissenschaftler FRET-Signale in intakten, lebenden Zellen schnell und reproduzierbar detektieren. Ausschlaggebend für die FRET-Analyse mittels Durchflusszytometer sind die richtige Gating-Strategie und die damit verbundenen Kontrollen (Details dazu finden Sie in der oben genannten Publikation). Die Protein-Interaktionen kann man im Anschluss an den FRET-FACS-Lauf anhand der Prozentzahlen FRET-positiver Zellen quantifizieren.

Die FRET-FACS-Methode ist für die Analyse verschiedenster Protein-Interaktionen geeignet. Wir haben mit ihr unter anderem virale Protein-Interaktionen in lebenden Zellen analysiert, Proteinbindedomänen charakterisiert sowie Multimerisierungen nachgewiesen. In Zukunft wollen wir die Methode einsetzen, um in Hochdurchsatz-Screens Inhibitoren für etablierte Interaktionen zu finden und unbekannte Protein-Interaktionen zu identifizieren.

C. Banning & M. Schindler



Letzte Änderungen: 26.04.2010