Stufengele sind ein einfacher Ersatz für Gradientengele. Aber es geht noch simpler.
Wie von Rehm et al. in Laborjournal 9/2014 (Seite 74) erwähnt, geht das Gießen von Gradientengelen schon mal daneben. Diese Schwierigkeiten kann man durch Herstellen von Stufengelen umgehen.
In der AG Biochemie am Department für Neurowissenschaften der Universität Oldenburg verwende ich folgenden Trick, wenn ich hoch- und niedermolekulare Proteine in einem Gel trennen muss. Ich gieße ein ganz normales 7,5%iges Trenngel mit einem 5%igen Sammelgel. Nachdem alles polymerisiert ist, starte ich die Elektrophorese ohne Marker und Proben bei 200 Volt. Nach 20 Minuten stoppe ich, trage die Proben und den Marker auf und führe die Elektrophorese für weitere 25 Minuten bei 200 Volt durch.
Im anschließenden Western-Blot werden sowohl hoch- als auch niedermolekulare Proteine hervorragend transferiert, da die Porengröße des Gels optimal für alle Proteine passt. Diese Methode ist sehr kostengünstig, da man nur ein 7,5%iges Gel gießen muss.
Alternativ kann man auch ein 7,5%iges Trenngel, das mit Tris/Gycinpuffer 375mM pH 9,5 gegossen wurde mit einem 5%igen Sammelgel kombinieren, das mit Tris/Glycinpuffer 125mM pH 9,5 hergestellt wurde. Nach der Polymerisation wird die Elektrophorese mit Proben und Markern für 35 Minuten gestartet.
Wichtig ist hierbei, wie bei allen anderen Gelsystemen, den „Prestained“-Marker mit Hilfe eines „Unstained“-Markers zu kalibrieren.
Tris-HCL-Gel (l.), Tris-Glycin-Gel (r.). Bahn 1: Unstained Marker; Bahn 2: Prestained Marker.
Werner Säftel
AG Biochemie
Department für Neurowissenschaften
Universität Oldenburg