Bei Lumineszenz-basierten Proteasom-Assays verzichtet man lieber auf fetales Kälberserum in den Zellsuspensionen.
Niemand weiß genau, was in fetalem Kälberserum alles enthalten ist. Eine Chymotrypsin-ähnliche Proteasom-Aktivität gehört offensichtlich auch zu den Inhaltsstoffen.
Damit das Proteasom seinen Job als Proteinhäcksler möglichst effektiv ausführen kann, ist es mit gleich drei proteolytischen Aktivitäten ausgestattet: einer Trypsin-ähnlichen, einer Chymotrypsin-ähnlichen und einer Caspase-ähnlichen. Die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität lässt sich sehr einfach mit kommerziellen Proteasom-Assays bestimmen, die ein kurzes Peptid mit einem Aminoluciferin-Anhängsel als Substrat für das Proteasom enthalten. Das Proteasom kappt die Peptid-Bindungen und setzt Aminoluciferin frei, das von einer Luciferase umgesetzt wird. In einer zweistufigen Reaktion resultiert hieraus ein Lumineszenz-Signal das von einem entsprechenden Lesegerät detektiert wird.
Eigentlich ein simpler Test, bei dem nicht all zu viel schief gehen kann. Dachte auch die Gruppe von Johanna Weiss vom Universitätsklinikum Heidelberg, die mit dem Lumineszenz-Assay die Chymotrypsin-ähnliche Proteasom-Aktivität nach Zugabe des Proteasom-Inhibitors Bortezomib in verschiedenen Myeloma-Zelllinien untersuchen wollte.
Wie im Protokoll des Assay-Herstellers vorgegeben, mischte die Gruppe eine Pufferlösung, die Luciferase und das Proteasom-Substrat Suc-LLVY-Aminoluciferin enthielt, mit dem gleichen Volumen einer Myeloma-Zellsuspension in Zellkulturmedium, das mit zehn Prozent fetalem Kälberserum (FCS) angereichert war.
Weiss und ihre Kollegen staunten nicht schlecht, als sie in den Kontrollnäpfchen der Mikrotiterplatte, die nur mit Zellkulturmedium gefüllt waren, einen satten Lumineszenz-Hintergrund detektierten. Je nach verwendeter Zelllinie und Zellzahl lag dieser bei bis zu zehn Prozent der Lumineszenz, die die Gruppe für unbehandelte Myeloma-Zellen maß (Dettmer et al., Analytical Biochemistry 471, 23-25).
Um der Sache auf den Grund zu gehen, besorgte sich die Gruppe FCS von drei verschiedenen Herstellern, setzte dieses den Medien zu und bestimmte in diesen anschließend die Proteasom-Aktivität. Als Kontrolle diente FCS-freies Medium. In den FCS-freien Kontrollen war alles in Ordnung, ein entsprechendes Balkendiagramm zeigt nur ein minimales Lumineszenz-Signal (siehe Fig.1 in der Originalarbeit). Ganz anders sah es bei den Medien aus, die mit den drei verschiedenen Kälberseren versetzt waren. Ein Balken geht hier durch die Decke, die beiden anderen zeigen deutlich schwächere Lumineszenz-Signale, die aber immer noch sechs bis siebenmal höher sind, als die der FCS-freien Kontrolle.
Weiss und Co. verdächtigten schnell FCS als Auslöser für die merkwürdige Chymotrypsin-ähnliche Proteasom-Aktivität und erhitzten das Serum, bevor sie es für den Assay einsetzten. Zu ihrer Verblüffung reduzierte die Hitzebehandlung die Proteasom-Aktivität in den FCS-haltigen Medien nur unwesentlich. Den endgültigen Beweis, dass eine Proteasom-ähnliche Aktivität in den verwendeten Kälberseren ihr Unwesen trieb, lieferte ein Versuch mit den Proteasom-Inhibitoren Bortezomib und Carfilzomib. Die Gruppe setzte den FCS-haltigen Medien eine Stunde vor den Proteasom-Assays unterschiedliche Konzentrationen der Inhibitoren zu und bestimmte anschließend die Proteasom-Aktivität. Wie erwartet wurde diese konzentrationsabhängig von beiden Inhibitoren gehemmt.
Fetales Kälberserum enthält demnach eine Proteasom-ähnliche Aktivität, der auch eine Hitzeinaktivierung nichts anhaben kann. Die Gruppe von Johanna Weiss empfiehlt deshalb Proteasom-Assays nur mit Zellen durchzuführen, die in PBS oder FCS-freiem Medium suspendiert sind.
Harald Zähringer