Das EtNa-Verfahren vereinfacht die DNA-Extraktion aus Mikroorganismen. Foto: Universität London
Ethanol, NaOH und 80 °C − mehr braucht es nicht, um DNA aus Bakterien und Hefen gleichzeitig zu extrahieren.
Nahezu alle Methoden für die Extraktion genomischer DNA (gDNA) aus Mikroorganismen basieren auf der Lyse der Zellen mit Guanidinthiocyanat und der anschließenden Reinigung der gDNA mit Hilfe kleiner Silica-Säulen. Bei Gram-negativen Bakterien funktioniert dies problemlos, bei Gram-positiven Bakterien oder Hefen muss man jedoch meist etwas nachhelfen, um die stabile Zellwand zu knacken. Hierzu sind zum Beispiel einige Runden auf dem Vortexer in Gegenwart von Glaskügelchen nötig; oder Enzyme, die die Zellwand auflösen.
Durch diese Zusatzbehandlung zerbröselt aber oftmals nicht nur die Zellwand, auch die gDNA wird häufig in kleine Fragmente zerlegt. Zudem enthalten klinische Proben in der Regel einen wilden Mikroben-Cocktail, in dem sowohl Gram-negative und Gram-positive Bakterien wie auch Hefen vorhanden sind. Um maximale Ausbeuten mit möglichst intakter gDNA zu erzielen, sind in diesem Fall verschiedene Extraktionsprotokolle nötig, die auf den jeweiligen Mikroorganismus zugeschnitten sind.
Da die Durchführung der unterschiedlichen Extraktionsverfahren sehr mühsam und zeitaufwändig ist, entwickelte die Gruppe des Mikrobiologen Eric Frost von der Universitätsklinik in Sherbrook, Kanada, ein universelles Protokoll für die Isolation von gDNA aus Mikroorganismen (BioTechniques, 2015, 58:120-25).
Die Kanadier modifizierten hierzu ein von ihnen seit gut zehn Jahren benutztes, aber nie publiziertes Verfahren für die Extraktion von gDNA aus Staphylococcus aureus sowie Mycobacterium tuberculosis. Frosts Gruppe suspendiert bei diesem die pelletierten S. aureus oder M. tuberculosis Bakterien in einer 61%-igen, alkalischen (0.1 M NaOH) Ethanol-Lösung und erhitzt die Suspension für zehn Minuten auf 70 °C. Die hieraus erhaltene Einzelstrang-DNA (ssDNA) resuspendieren Frost und Co. und setzen sie anschließend in der PCR ein.
Um mit dieser Technik auch die zähen Zellwände von Hefen und Gram-positiven Bakterien knacken zu können, mussten die Kanadier lediglich die Temperatur auf 80 °C und die Konzentration der NaOH auf 0.2 M erhöhen. Die Integrität der gewonnenen gDNA beeinträchtigt dies nicht.
Konkret sieht das von den Kanadiern als EtNa bezeichnete Extraktions-Protokoll wie folgt aus: Zu 100 Mikrolitern einer Bakterien- oder Hefesuspension gibt man 455 Mikroliter EtNa-Extraktionslösung (240 mM NaOH, 74 % Ethanol, 2,7 mM EDTA) und mischt kurz durch. Die Suspension erhitzt man zehn Minuten auf 80 °C und zentrifugiert die Lösung anschließend zehn Minuten bei 16,060 g. Nachdem man den Überstand abgehoben und verworfen hat, suspendiert man das Pellet in 100 Mikroliter DNA-Suspensionslösung (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 1 % Triton-X-100 und 0.5 % Tween 20).
Wer die Reinheit der isolierten gDNA verbessern will, kann dieses EtNa-Crude-Protokoll auch mit Silica-Spinsäulen kombinieren und zum EtNa-Pure-Verfahren ausbauen. Hierzu trägt man die nach Erhitzen auf 80 °C erhaltene Mischung auf die Säulchen auf und hält sich bei den weiteren Schritten an das Manual des Säulen-Herstellers.
Im Gegensatz zur üblichen Extraktion mit Guanidiniumthiocyanat liefert die EtNa-Methode größtenteils Einzelstrang-DNA. Da auf die DNA-Extraktion in den meisten Fällen eine PCR folgt, sollte dies jedoch kein Problem sein.
Den größten Vorteil ihres Verfahrens sehen die Autoren in der Gefahrstoff-freien, schnellen und kostengünstigen Extraktion von gDNA aus unbekannten Mikroorganismen, etwa bei der gleichzeitigen Suche nach Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien sowie Hefen als Auslöser von Infektionen.
Harald Zähringer